rt - qpcr -事实与谬误:斯蒂芬·布斯汀教授访谈
自COVID-19大流行开始以来，诊断检测一直被强调为遏制SARS-CoV-2传播的全球措施的关键组成部分。在一个新闻发布会上2020年3月16日，世卫组织总干事谭德塞博士表示，检测、隔离和接触者追踪是“应对措施的支柱”，并敦促所有国家“检测、检测、检测”。
RT-qPCR检测可以检测患者样本中存在的SARS-CoV-2遗传物质，很快成为识别感染者的主要方法。然而，在整个大流行过程中，关于聚合酶链反应的能力和价值的一些说法和指控一直在传播，导致对其使用的质疑。
为了解决这些误解，并传达该技术的真正优势和局限性，一组PCR专家最近发表评论在国际分子科学杂志．188金宝搏备用很高兴与安格利亚鲁斯金大学分子医学教授、评论的主要作者Stephen Bustin教授进行了交谈，以了解更多关于突出的一些事实和谬误。
以下仅代表Stephen Bustin个人观点，并不代表安格利亚鲁斯金大学的官方政策或立场。
安娜·麦克唐纳(上午):RT-qPCR在大流行开始时迅速被采用，成为检测SARS-CoV-2的主要方法。你能描述一下使它成为合适选择的技术的一些关键优势吗?
斯蒂芬·布斯汀(SB):事实上，中国科学家在新冠病毒基因组序列公布后一天内设计了前三个PCR检测试剂盒。这种闪电般的速度在任何基于抗原的测试中都是不可想象的，因此PCR是主要的方法。此外，合理设计、优化和验证的RT-qPCR检测方法是检测病原体最敏感、特异、可靠和可靠的方法。目前的检测方案还没有抗原检测那么快，但将来也会如此(见下文)。
至关重要的是，RT-qPCR检测也很容易修改，以适应突变和变体的出现，因此具有异常的灵活性，这是处理与最初预期相反的持续快速变化的RNA病毒的一个重要优势。一旦通过测序确定了具有变异特征的基因变化，设计测试就很简单了，最重要的是，可以立即使用它们。同样，这与抗原测试不同，抗原测试需要开发和生产新的抗体，这个过程需要几个月的时间，而且非常昂贵。PCR检测可以区分原始病毒和变体病毒，即使它们之间仅存在一个核苷酸变化(例如，变体B.1.1.7 N501Y在编码刺突蛋白的序列中发生了从a到T的核苷酸变化)。
虽然主流PCR仪器需要30分钟到1.5小时才能完成一次检测，但结合快速方案和仪器可以将时间缩短到15分钟以内。即使这样也没有充分利用这项技术的潜力，“极端”PCR显示在不到20秒的时间内完成测试。我毫不怀疑，在一两年的时间里，这样的工具将会商业化。此外，还将出现廉价的手持个人和即时护理设备，可以在需要的时间和地点迅速提供结果。
AM:已经有一些说法表明，基于pcr的检测不适合目的。是什么导致了这些指控?这种错误信息有什么影响?
某人:这些情绪产生于故意传播虚假信息，加上误导性的引用和不完整的报道。它们是由那些知识很少、对技术不了解的人制作的，但他们口齿伶俐，依赖于公众对科学细节的无知和缺乏兴趣。媒体也有责任，因为他们通常无法区分基于数据和事实的权威科学结论与基于谎言和诡辩的虚假和不可靠的观点。
最常见的错误是聚合酶链反应的发明者卡里·穆利斯(Kary Mullis)声称聚合酶链反应不应该用于诊断。他确实对诊断测试的可靠性做了一个不幸的评论，但这是专门针对艾滋病患者中艾滋病毒的检测，针对的是传统的基于凝胶的PCR，并且是在1993年做出的，当时实时PCR (qPCR)还没有被用作诊断工具。我个人认识Kary Mullis，我确定这不是我们讨论的他的观点，他对使用RT-qPCR作为结直肠癌患者的预后工具很感兴趣。
毫无疑问，qPCR非常适合用于病原体的诊断测试，至少有三个原因:(1)它有两个级别的特异性，最大限度地降低了假阳性结果的风险;(2)它的敏感性最大限度地降低了假阴性结果的风险;(3)作为一种封闭管程序，扩增的DNA永远不会释放到环境中，最大限度地降低了污染的机会。在某种程度上，我们正在看到同样不诚实的运动复活，在20世纪90年代末，关于MMR疫苗和自闭症，它造成了许多不必要的心痛。
这些行动是由怀有目的的冷酷无情的个人和团体推动的，不幸的是，他们不接受任何形式的说服。聚合酶链反应(PCR)检测只是另一个与当今的教条纠缠在一起的话题，这种教条认为感觉和观点与事实同样重要，甚至比事实更重要，这种现象在政治、教育以及与健康相关的环境中已经很常见。虽然很容易想出一个简单的口号来诋毁某件事，并将一个复杂的问题简化为一个简单的流行短语，但要充分而敏感地解释这个问题却需要更长的时间。最终，在我们的社会中有一种讨厌的边缘元素，他们对倾听和学习不感兴趣，可悲的是，对愚蠢既没有疫苗也没有治疗方法。这种趋势的一个严重后果是，公众无法区分真正的学术研究和平衡的专家建议与骗子和江湖骗子兜售的蛇油。
AM:你能解释一下出现假阳性或假阴性结果的主要原因吗?我们可以做些什么来减少这种情况的发生?
某人:在经过正确验证和ce标记的PCR检测中，假阳性结果是由污染或对结果的不恰当解释引起的。污染可能在取样过程、提取过程或PCR检测试剂的分配过程中引入。通过在每个阶段包括适当的阴性对照，即不包含目标RNA或DNA的样品，可以常规检测到这一点。这些控制必须始终是消极的;如果它们是，PCR结果是阳性，这意味着被放大的目标是存在的。当存在很少的目标并且分析生成的结果接近测试的检测极限时，这一点尤其重要。PCR测试的“分析灵敏度”指的是样本中可以检测到的目标的最小数量，理论上这是一个单一分子。它与“分析特异性”齐头并进，它描述了检测检测一个特定靶标的能力，例如SARS-CoV-2，与SARS-CoV不同。
然而，两者都不同于“诊断敏感性和特异性”，前者指的是检测识别感染个体的能力，后者指的是其正确识别未患病个体的能力。因此，真正的PCR阳性很可能检测不到传染性病毒，例如，如果个体在患病后几周内没有症状，尽管存在一些病毒颗粒或核酸片段，但它们与临床无关。因此，错的是对测试的解释，而不是测试本身。这是一个真正的问题，原因有二(1)SARS-CoV-2的感染剂量仍然未知;(2)qPCR结果输出是量化周期(Cq)，这不是一个客观值，但因仪器、试剂和操作人员的不同而有所不同。监测包括症状、感染概率和PCR结果在内的参数组合是最大限度减少临床假阳性的最佳方法。
另一方面，假阴性可能是由于样品在处理或存储过程中降解引起的，这对于RNA、抑制剂的存在、糟糕的测试方案、缺乏经验的工作人员没有遵循适当的程序以及最不可能的试剂失效尤其有问题。也可能是从一个人身上提取的样本不含任何病毒，或者病毒含量太少，以至于在提取过程中丢失或过度稀释。当然，这就是为什么阴性的检测结果实际上是推定的阴性，如果个人处于感染的早期阶段，一天左右的第二次检测很可能会得出阳性结果。
AM: 2009年，你出版了MIQE指南，旨在鼓励更好的实验实践和更可靠的qPCR结果解释。COVID-19检测是否使用了这些指南?如何应用该指南来改进qPCR检测的使用?
某人:MIQE准则是针对研究界的，在研究界，针对多种目标的新测试正在不断开发，很难将一个实验室产生的结果与另一个实验室获得的结果进行比较。此外，它们涉及定量检测，这与SARS-CoV-2的检测略有不同。
然而，这些指南是相关的，因为它们要求在分析设计、测试性能报告和结果解释方面具有透明度。研究人员和公司在开发一系列敏感和特定的检测方法方面做了出色的工作，并继续监测新菌株的出现，以确保他们的测试继续产生可靠的结果。在分享正在使用的各种测试的顺序细节方面应该更加开放，但所提供的信息通常是可靠和翔实的。
然而，导致测试可靠性出现一些问题的主要问题是采样、传输和提取工作流程，这远远不是最优的。有许多不同的试剂和方案，取样人员的技能水平不一，运输实践中的不同时间线和不一致的存储条件，以及不同的RNA提取和浓缩程序，这些都增加了测试结果的可变性，特别是在比较不同国家内部或不同国家之间的不同测试中心时。迫切需要制定一套明确的最佳样本收集指南，这些样本应该来自SARS-CoV-2的唾液以及RNA提取，这将有助于标准化，从而使整个过程更加可靠。
AM:使用qPCR来定量病毒载量是一个特别值得关注的领域。为此目的使用该技术的主要挑战是什么?有什么措施可以减少结果的不确定性吗?
某人:首先，区分感染剂量和病毒载量是很重要的。目前尚不清楚SARS-CoV-2的感染剂量是多少，即使人生病所需的病毒量。它的传播容易程度表明它可能相当低，但这可能是100、1000或10,000个病毒颗粒。更高的感染剂量可能导致更高的病毒载量，这是指在受感染个体的细胞内复制的病毒数量。有证据表明，较高的病毒载量会导致更严重的症状，并可能与更糟糕的结果相关，并导致受感染者排出更多的病毒。
标准的qPCR检测不能记录准确的病毒拷贝数，因为阳性样本的检测结果只记录了一个PCR周期数，例如25.5。这意味着该仪器在25.5个循环后首次检测到目标的存在，而较低的Cq值表明有更多的目标存在，没有额外的信息，不可能知道有多少。这需要了解放大效率，因为很明显，效率更高的测试会比效率较低的测试更早地记录较低的Cq。
定量还需要添加标准，理想情况下，已知拷贝数的认证参考RNA，在特定的PCR周期数上扩增。然后，病毒的周期数可以直接与该标准相关，并给出数量的度量。不幸的是，这样的标准仍然不存在。有一种相关的技术叫做数字PCR，可以提供病毒拷贝数的绝对计数。然而，这种技术不适合大规模测试，而且价格昂贵。就目前而言，最好的解决方案是将检测结果记录为阳性或阴性，并在个人临床背景下解释该结果，如果有疑问，一天左右再重复一次。
AM:你认为疫情在哪些方面影响了PCR的未来?
某人:毫无疑问，医院、养老院、托儿所、机场、邮轮等将对持续快速检测产生巨大需求，最初是针对SARS-CoV-2，但将扩展到其他呼吸道病毒以及真菌和细菌病原体。这将推动易于使用的采样、提取和测试设备的发展，这些设备可以在很少或不需要操作员干预的情况下快速测试多个样品。
与此同时，对更多个人设备的需求也将不断增长，比如基于手持微流体的系统，在这种系统中，你可以添加少量的唾液、血液、尿液或粪便物质，并在自己家中、全科医生的外科手术中甚至在化学家那里获得快速的检测结果。聚合酶链反应的速度潜力及其同时检测众多目标的能力在很大程度上仍未被探索，专注于改进当前的协议，引入新的仪器和改进的试剂只会使聚合酶链反应比现在更加普遍。
参考:Bustin S, Mueller R, Shipley G, Nolan T. COVID-19和rt - qpcr对SARS-CoV-2的诊断检测-事实和谬误。Mol科学．2021; 22(5): 2459。doi: 10.3390 / ijms22052459
Stephen Bustin教授接受了科技网络的科学作家Anna MacDonald的采访。188金宝搏备用
