蛋白质组学的发展——加里Kruppa博士
加里Kruppa蛋白质组学博士,副总裁,力量Daltonics公司,有超过30年的经验领域的质谱(MS),在担任副总裁力量Daltonics 20多年了。
Kruppa收到他的化学物理博士学位加州理工学院的和他的废话特拉华大学。Kruppa监督市场和应用开发管理力量的蛋白质组学研究创新的解决方案。
这部分的蛋白质组学的发展,Kruppa讨论了最近的技术进步,推动MS-based血浆蛋白质组学的生物标志物的发现。
莫莉·坎贝尔(MC):你能提供一些背景知识需要新的等离子体生物标志物吗?新方法如何改进生物标志物发现呢?
加里Kruppa(门将):许多现有的诊断方法,目前基于蛋白质的抗体绑定可以翻译MS-based化验,提高特异性。李·安德森的评审论文人类血浆蛋白质组早在2002年提供了一个很好的参考两种血浆蛋白质组学的优势,如井其固有的挑战。
有一个未满足的需要新的生物标志物对许多疾病,但等离子体的蛋白质含量非常复杂,要发现和验证一个挑战。许多癌症目前没有已知的等离子体生物标志物,这将彻底改变病人护理的早期检测。新技术对生物标志物的发现,以及仪器灵敏度高和鲁棒性,必须满足这种需求。丰富的生物标记物早期癌症在等离子体可能会很低,所以很好的灵敏度和高覆盖率的等离子体中的蛋白质需要检测这样的生物标志物。
主持人:除了药物之外,其他科学领域中可以受益于蛋白质组学吗?
GK:新的蛋白质组学技术的发展是制药药物开发的关键。许多药物靶点是蛋白质,因此获得更深入地理解细胞的机制,影响正常浓度范围,流动率,可访问性为合适的目标蛋白质的口袋,protein-lipid复合物在细胞表面和多个目标或非目标击中MS-based蛋白质组学可以帮助解开是重要的因素。一旦研究人员有了一个合适的目标和药物目标,他们想要评估蛋白质组配置文件,以确保他们击倒目标蛋白的表达和影响途径。更敏感的方法,你可以学习小和脱靶对蛋白质组的影响。
大部分早期药物开发是在细胞培养中完成的,所以灵敏度和动态范围不一样的问题,因为他们是在等离子体,但整个范围的医药科学为众多应用蛋白质组学很感兴趣。在生物学领域,宏蛋白质组学研究的主要领域,包括生物如何交互的研究,生物存在,他们的蛋白质组是如何受到这些交互作用的影响。
宏蛋白质组学的一个关键领域包括人类肠道微生物的研究,从基础科学的角度和研究人类微生物组对健康的影响。Host-pathogen蛋白质交互网络(PPI)是另一个关键的重点领域,在药物开发可以根据目标病毒传染疾病,如Zika病毒、登革热或埃博拉,劫持宿主的细胞蛋白质机械,宽往往会导致人类疾病,甚至死亡。
主持人:你能解释一下4 d匹配的使用,这对生物标志物的发现意味着什么?
GK:4 d匹配对生物标志物的发现有一个巨大的影响,制药药物开发,像宏蛋白质组学和PPI和字段。在标准的自下而上的蛋白质组学研究中,蛋白质组消化和肽检测到洗提从液相色谱(LC)系统。LC柱上的保留时间是一维的分析,质量测量第二个维度,峰的强度是第三维度。合成3 d峰集成,这反映了肽的强度,由MS / MS确定了,告诉你它来自蛋白质,通过推理样品中蛋白质的多少。
四维(4 d)是指离子流动,已经存在了数年,但并没有被经常用于蛋白质组学。的发明被困的离子迁移谱法(蒂姆)力量使得离子迁移率的常规使用蛋白质组学成为可能。此外,并行accumulation-serial碎片(PASEF)扫描技术在蒂姆斯细胞、增加灵敏度和速度。随着离子被困,然后洗提他们的机动性的函数,这些额外维度的信息可以用来改善识别。多个肽co-elute nano-LC列,其独特的碰撞截面(CCS)允许蒂姆斯细胞进一步气相分离,允许更多的多肽。这气相分离的蒂姆是第四维除了保留时间,质荷,和强度,称为4 d匹配。
的好处4 d匹配由于PASEF扫描允许研究人员识别低丰度蛋白,如组织泄漏信号蛋白质或蛋白质,与更高的信心和所需的高灵敏度。例如,对于数据依赖分析(DDA / PASEF), CCS的值将被用作一个额外的识别标准在搜索引擎提供肽鉴定的信心。对于data-independent分析(DIA / PASEF),或一个中间方法称为“运行之间的匹配”,您可以使用CCS值作为一个独特的肽签名帮助对齐功能,增加对任务的信心。
司仪:什么阶段参与的开发新技术用于蛋白质组学研究?
GK:首先,你必须确定一个特定的应用程序的未满足的需求,通常在蛋白质组学是蛋白质组的报道的深度、速度和灵敏度。有大量的蛋白质在等离子体中,在一个令人难以置信的动态范围,这是主要的未满足的需求,多年来一直被公认。
当你想把更高的灵敏度和动态范围,提高特异性,质谱仪的灵敏度和速度,你必须记住,在诊所,样品必须迅速进行分析。这是另一个未满足的需求,能够生成一个蛋白质组从一个人在一个小时内以合理的成本,以确保适用性在诊所。研究人员可能愿意花几个小时到几天在单个样本寻找生物标志物,但验证不能花这么长的时间,因为你需要一个至少一千个样本,因此你需要一个工作方法,可以在一个小时或更少。常规应用程序在诊所每天成千上万的患者,要更短。
鲁棒性是另一个需要满足。定期测量病人的蛋白质组,定期进行比较,结果必须复制为了观察病人的变化,而不是仪器的性能。因此,你需要一个非常健壮的质谱仪。除了4 d匹配能力,增加了特异性,和速度,使您能够实现更多的目标,鲁棒性力量的timsTOF Pro是一个很大的优势。
一旦确定的未满足的需求,为了解决这些问题,我们必须开发解决方案。在许多情况下,合作伙伴和合作也是至关重要的。力量与商业和学术软件合作伙伴紧密合作,如。生物信息学解决方案公司(生产商峰值蛋白质组学软件),MaxQuant,天际线,蛋白质标准公司。(生产商Byonic™)帮助深入挖掘结果。
我们还与色谱专家合作,最大化的鲁棒性和速度。样品注入一个LC系统分离肽,一般用于敏感性,这是完成了nanoflow色谱法。然而,替代方法可能更适合临床应用因为nanoflow可以带来一些实际的挑战。
timsTOF Pro, nanoflow色谱法是一个瓶颈,我们有与Evosep已经开发了一个非常健壮的、高通量LC系统,Evosep,适度低流速,适合临床研究应用。通过与不同的公司和学术机构合作,我们可以帮助加快发展,将来自不同来源的最佳实践来满足这些需求。
主持人:在你看来,什么是最令人兴奋的蛋白质组学研究领域的技术发展到目前为止?你看到什么重大进展在蛋白质组学研究领域的未来?
GK:即使经过近25年的蛋白质组学,该领域仍在很大程度上分散,尤其是与基因组学和具有里程碑意义的人类基因组测序完成的工作文特尔和着陆器在2000年代中期。
在蛋白质组学,挑战仍在实现相关蛋白质组学深度在最短的时间内,这并非易事,因为人类基因组包含大约20000个蛋白编码基因。实现所需的蛋白质组学深度,鉴于现代质谱仪的工作周期,采用两种互斥的方法,每个都有它的优点和缺点;DIA银两和“运行之间的匹配”哲学。
此外,质是一种用连字符连接技术、LC段nanoflow和微流方法,每种方法都有其优点和缺点。所以与DNA测序仪,受益于PCR扩增,把重点从分析技术本身,蛋白质组学很大程度上仍依赖于进步在质和在生物信息学中,试图破译复杂信息获得每秒。
的Orbitrap质谱仪高分辨率,精确的质量数据,常规进而引发生物信息学工具,使用准确的质量信息分析大大提高信心。这关键的发展导致MS-based蛋白质组学的广泛使用,导致快速推进。timsTOF Pro PASEF技术代表了一个新的阶梯式MS-based蛋白质组学,是增加了一个额外的关键限定词——肽CCS的值。即使在今天,色谱保留时间在生物信息学中起着关键作用,所以添加肽CCS价值观——一个关键的气相分离肽的签名——可以成倍地提高分析的信心减少错误发现率,发现多个网站多功能天车同一肽序列,并深入到蛋白质组通过触发MS / MS windows在某些离子的机动性。所使用的这种独特的CCS签名可以方便地添加一个智力水平,例如在immunopeptidomics(和其他non-tryptic肽,目标蛋白质组学)使用PASEF触发平行反应监测(人口、难民和移民事务局),或连接各种PPI宿主-病原体感染途径研究发现新的药物。
领域快速发展在过去的25年里,感谢MS-based蛋白质组学的不断进化。大幅改进的健壮性和速度性能timsTOF箴使大型队列研究成为可能,类似于影响了全基因组关联研究(GWAS)。我们相信,蒂姆斯/ PASEF方法关键CCS-peptide签名信息,一起进步在机器学习能力的生物信息学工具,让它使蛋白质组学的一个重要考虑更具临床相关。
加里Kruppa与莫莉坎贝尔说,科普作家、技术网络。188金宝搏备用
