与PASEF加速蛋白质组分析:一个独特的和敏感的技术

了解生物的蛋白质组是一个基本的挑战。任何大规模、proteomics-related研究将需要能够可靠地识别尽可能多的蛋白质组的组件。高分辨率质谱(MS)的蛋白质组学已发展成为一个高度有效的工具来分析成千上万的蛋白质。

质谱仪的灵敏度现在市场上使科学家能够深入了解整个蛋白质组,检测蛋白表达模式和最终,识别和描述蛋白质的行为在特定的环境下,生理疾病或条件。因此,蛋白质组学的应用很多,例如确定临床分子诊断的生物标志物,理解抗菌素耐药性,以及转录后修饰的大规模分析(天车)。

一个革命性的新方法,并行积累串行碎片(PASEF),可用timsTOF™Pro质谱仪(力量Daltonics)将改变蛋白质组学领域通过提供更快、更敏感、更健壮的蛋白质组分析,给科学家可能发现低级,生物学上重要的蛋白质和验证研究。

获取的数据

与传统的生物化学和生物物理方法相比,MS-based技术可以执行大规模蛋白质组的系统测量、生成生物见解从蛋白质组学数据集[1]的计算分析。这种方法使决定性的识别和精确量化的几乎所有的蛋白质表达。

主要有两种方法来研究蛋白质的女士:完整的形式通过自上而下的蛋白质组学或使用自底向上方法消化蛋白质和识别多肽。自上而下的蛋白质组学的优点是测量任何转录后修饰(天车),使proteoforms充分的特点。然而,自上而下开展高通量蛋白质组学是许多实验室、挑战性,更难以分析蛋白质与多肽。自底向上的蛋白质组学涉及到蛋白质的提取从源材料和消化这些蛋白质的肽,经常与sequence-specific酶如胰蛋白酶,之前使用液相色谱分离与女士(LC)和随后的分析。

自底向上的蛋白质组学中使用的主要方法是猎枪(或发现)蛋白质组学,使用视数据采集(DDA)无偏和完整的蛋白质组报道。它重视最多的剖析与高度的特异性肽,和研究员的身份不需要知道事先预期的蛋白质。质谱仪在谈判模式中获得质谱在几秒钟内扫描整个质量范围和破碎尽可能多的肽在一个特定的时间框架,这是理想的探索研究。然而,挫折的DDA方法测序速度和,因此,只有洗脱肽的比例可以分散。改进技术和女士被困的引入离子迁移谱法(蒂姆)结合PASEF方法大大增加了猎枪的测序速度与基于蛋白质组学。

PASEF是一个新兴的方法使一些前体离子存储并行捕获离子移动设备,可以遵循与串行碎片。它允许每秒数百MS / MS事件,在完整的敏感性,提供多方面的速度和灵敏度增加相比传统技术[2],并增加谈判。

高灵敏度和高速度得益于PASEF猎枪蛋白质组学技术使它次转会为分析样本,非常有限的样本是可用的,例如在活检。一个完全开放的数据文件格式允许研究人员直接处理原始数据在使用软件猎枪蛋白质组学分析,如MaxQuant。山峰工作室是另一个软件包支持数据分析女士,有小说从头测序算法集成到传统的数据库搜索,确保原始光谱数据的完整解释。解决方案处理女士数据的复杂性,发展蛋白质组学研究通过肽/蛋白识别和量化,肽映射和天车特征(图1)。

图1:平行积累串行碎片(PASEF) label-free定量(LFQ)。增强灵敏度、速度和再现性增强LFQ ID利率是重要条件的性能。LFQ强度海拉的一式三份分析(200 ng, 90分钟梯度)R2 > 0.99。

简化复杂的信号

PASEF技术可以专门应用于商旅四极飞行时间质谱仪(QTOF),添加一个额外的维度的分离标准女士扫描。离子迁移谱已经使用在许多应用程序中,如生物分子结构的表征和高通量分离复杂混合物——多年来,这些系统往往是耦合的飞行时间(TOF)最近,女士TIMS-QTOF女士已经开发了复杂的分离和鉴定蛋白质的消化。

例如,一组在马克斯·普朗克生化研究所表明的使用PASEF女士TIMS-QTOF猎枪蛋白质组学。图2显示了timsTOF Pro的结果分析一个完整的四个消化蛋白质的混合物;乙醇脱氢酶(ADH)、牛血清白蛋白(BSA)、烯醇酶、磷酸化酶b,直接注入质谱仪[2]。图2对光谱强调重叠信号的复杂性的质谱没有离子流动分离,与蒂姆斯分离简化热图(图2)。四种离子的顺序隔离在不同的m / z流动分离的平行积累后如图2 b,然后应用PASEF, MS / MS扫描进行孤立的前兆,导致一个典型的阶梯分散离子(图2)。预计质谱右边的框所示的面板。

图2:困离子迁移谱法(蒂姆)四极电喷雾飞行时间(QTOF)分析多肽结合胰蛋白酶的消化的乙醇脱氢酶(ADH),牛血清白蛋白(BSA)、磷酸化酶b,烯醇酶。(A)嵌套m / z和离子流动分布在全扫描检测(B)女士四离子在不同的m / z顺序隔离后,由流动平行的积累。(C)并行积累−串行碎片(PASEF)的前体(B)的孤立。(D)到达时间分布的总结所观察到的碎片离子PASEF法配合四极隔离质量作为蒂姆斯斜坡时间的函数。预计质谱显示在右边的面板,在(C)白盒预计的碎片。

之间的这个研究的数据显示MS / MS四到十倍的增加速度完全使用PASEF敏感性。但什么是增加这样一个典型的猎枪的影响蛋白质组学数据?

临床应用

除了在相互作用蛋白质组学中的应用和PTM-related蛋白质组学,TIMS-QTOF女士是临床蛋白质组学研究中获得动力。蛋白质混合物来自患者样本可以用来通知很多疾病的诊断和治疗。分析通常用于常规的定性分析,但这种方法不能区分蛋白亚型——由MS-based蛋白质组学的一个挑战。TIMS-QTOF女士PASEF方法解决所面临的其他挑战自下而上的蛋白质组学为例,临床样本需要可再生的、健壮的和高通量样品制备工作流。特异性高,敏感性和吞吐量TIMS-QTOF质谱仪所提供的,如timsTOF Pro,辅以健壮性和再现性是由于低的组合所需的样本数量分析和离子光学的正交几何。这是非常重要的深入剖析复杂的蛋白质混合物,如人体组织或体液在临床蛋白质组学[3]。PASEF方法进一步增加的机会识别低丰度蛋白,例如在血浆中。

结论

MS-based蛋白质组学提供了大量的重要的见解组合、调控和分子途径的函数,对于更深入地理解复杂的生物学过程。新的技术创新,如PASEF MS-based蛋白质组学的方法,在生物学和医学将继续积极的影响,以其精确的识别和量化成千上万的蛋白质从复杂样品。

未来MS-based蛋白质组学的应用可能会进一步个性化医疗领域,可能使临床医生对病人进行分类到治疗耐药和非耐药结核杆菌组,因此推进靶向治疗的应用。测量disease-relevant生物标记也可以开发与MS-based蛋白质组学在未来,特别是使用TIMS-QTOF PASEF女士。

更多信息在力量timsTOF™Pro由PASEF供电,请访问https://www.bruker.com/products/mass-spectrometry-and-separations/lc-ms/o-tof/timstof-pro/overview.html

引用

1。约书亚对峙,马克·e·山脊路,弗兰克·h·Laukien马提亚曼,梅尔文a公园(2017)平行积累工作周期100%被困离子mobility-mass谱法,国际质谱学报,413卷,168 - 175页。http://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2016.03.004

2。Florian迈耶,鲜红的贝克,Niklas草原动物,马库斯吕贝克,梅尔文a公园,奥利弗Raether和马提亚曼(2015)并行积累−串行碎片(PASEF):测序速度和灵敏度乘以困离子移动设备同步扫描,蛋白质组研究期刊》的研究,14卷,页5378 - 5387。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.5b00932

3所示。红色贝克(2016)小说四极飞行时间质谱猎枪蛋白质组学。博士论文,Ludwig-Maximilians-Universitat,慕尼黑。