采访弗雷德·克雷默教授
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克雷默教授是罗格斯大学微生物学、生物化学和分子遗传学系的一员。在洛克菲勒大学获得博士学位后，他在哥伦比亚大学任教17年，然后将实验室搬到公共卫生研究所，在那里他与同事进行了29年的研究。
选择生物SEA:在完成动物学本科学习后，你在洛克菲勒大学完成了文森特·奥弗雷的博士学位。这段经历对你未来的研究兴趣有何影响?
克雷默教授:我开始成为一名发育生物学家，我解决了母体信使rna如何储存在青蛙的卵母细胞中，以便受精后使用的问题。这导致了体外实验的发展，评估存储的信使rna的数量。作为哥伦比亚大学的博士后，我继续从事体外实验，通过噬菌体复制酶探索RNA指数复制的机制，并导致了体外选择实验，其中RNA种群在复制抑制剂的存在下进化。不久，核酸分子本身就成了我的“实验动物”，研制结构和功能可被设计为有用用途的新型核酸分子成为我的激情所在。
Select Bio SEA:贵实验室在探索核酸结构方面有着悠久的历史。你能描述一下这些年来你参与的一些项目，以及你开发的一些实验性技术吗?
克雷默教授:这里有一些亮点:(1)在1989年，我们介绍了使用插层染料来实时跟踪核酸的指数扩增，我们注意到合成特定数量的核酸所需的时间与实验中最初出现的模板核酸数量的对数成反比(这种方法是实时PCR分析的基础);(2)与Fred Sanger的实验室合作，我们开发了核酸序列分析的链终止法，并引入了肌苷作为防止电泳过程中形成模糊测序结果的结构的手段;(3)我们开发了基于双功能重组rna作为探针的极其敏感的临床检测方法，然后通过Q-beta复制酶的孵育以指数级扩增以指示目标存在的数量;(4)我们发明了分子信标，这是一种荧光标记的杂交探针，在溶液中游离时是黑色的，但在PCR检测中与目标扩增子杂交时，就会以预先选定的颜色发出明亮的荧光;(5)我们引入了通过接触猝灭相互作用的非fret标记对，从而使许多不同的探针同时用于高度多样化的临床诊断分析。
Select Bio SEA:您目前的研究涉及与癌症相关的极其罕见突变的定量。你能告诉我们更多关于超选择性PCR引物以及它们在你的研究中是如何使用的吗?
Kramer教授:超选择性PCR引物被设计用来启动突变序列的扩增，而忽略相应的野生型序列，即使突变型和野生型之间的差异只是一个单核苷酸多态性。这些引物具有非凡的选择性和特异性的原因有两个:(1)从热力学上讲，由于引物与突变型目标序列形成了极短的杂交体，因此引物与突变型目标序列形成的完全互补杂交体比引物与野生型目标序列形成的不匹配杂交体要丰富得多;(2)由于这些短杂交体只持续不到一秒钟就会解体，而且不匹配的野生型杂交体的持续时间远远少于完全互补的突变型杂交体，因此数量更多的突变型杂交体在解体前与DNA聚合酶结合的几率要比迅速解体的不匹配野生型杂交体高得多。因此，从野生型序列产生扩增子的概率非常低，即使在包含1,000,000个野生型目标分子的样本中，也只有10个突变目标分子可以通过其阈值循环值定量。
Select Bio SEA:您认为液体活检在指导个体患者治疗方面有多重要?
克莱默教授:癌细胞无论出现在身体的哪个部位，都会迅速繁殖，也会因凋亡和坏死而迅速死亡，死亡细胞的基因组DNA被分解成碎片，最后进入血浆，这些碎片会持续一两个小时。血液样本的侵入性远小于肝活检或肺活检。分析血浆样本中存在的突变DNA片段可以提供有关癌症诊断、预后和治疗的有用的个性化信息。此外，可以相对频繁地采集血液样本，使治疗能够根据个人的特定医疗情况进行调整。
使用液体活检的挑战在于，来自癌细胞的突变DNA片段远不如来自正常细胞的DNA片段丰富，这就是我们开发超选择性PCR引物的原因。人们希望，对癌症相关突变进行极具选择性的多重检测，再加上相对容易地频繁抽取血液样本，将癌症从一种经常致命的疾病转变为一种慢性疾病，在这种疾病中，个人的治疗可以根据相关突变的早期检测做出调整。
Select Bio SEA:到目前为止，你觉得自己最大的成就是什么?
克雷默教授:我们实验室开发了一种快速PCR检测方法，利用五种不同颜色的分子信标来检测引起结核病的细菌，同时表明患者是否可能感染了耐多药细菌，需要更积极的治疗。这种由造父变星公司商业化的化验方法现在正在世界各地使用，并在防治这种地球上传播最广泛的传染病方面取得了重大进展。
Select Bio SEA:您未来还想从事哪些研究?还有其他计划项目吗?
克雷默教授:我们已经开发了颜色编码的分子信标，即使检测设备只能区分7种不同颜色的荧光信号，也有可能在一次数字PCR检测中定量多达35种不同的罕见突变序列。
选择生物科学东南亚分会非常高兴地邀请到Kramer教授作为我们的开幕主题演讲嘉宾qPCR和dPCR的第六年度进展会议将于5月21日至22日在新加坡坎宁堡酒店举行。
Kramer教授会讨论与癌症相关的极其罕见突变序列的多重检测
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