成功冷冻保存的4个秘诀

低温保存是一项关键的程序，可以帮助你长时间保存生物材料。虽然这是一种非常有效的方法，但它所涉及的试剂和技术如果使用不当可能会失败。在低温保存中，目的是利用低温保存结构完整的活细胞/组织。适当的设备必须到位，以确保一致性，可重复性和无菌性。必须在正确的温度下添加正确的冷冻保护剂的选择和数量，并且在采用标准化的低温储存方法之前必须应用控制的冷冻速率。本指南的目标是帮助您的细胞/组织成功完成从37°C培养箱到-196°C液氮储罐的热力学旅程，并长寿和繁荣。

选择合适的培养基

确保成功保存细胞/组织的第一步是找到合适的培养基。换句话说，您必须检查您使用的细胞/组织培养基是否正确。

防冷冻的代理

冷冻保护剂通过4种机制保护缓慢冻结的细胞/组织:降低高盐浓度，减少细胞收缩，减少冷冻溶液的比例和/或最大限度地减少细胞内结冰。低温保护剂的组合可能导致细胞存活的加性或协同增强。甘油、盐和二甲基亚砜(DMSO)是最常用的冷冻保护剂。如果使用的冷冻保护剂浓度极高，至少50%体积/体积，则可以消除冰的形成。

低分子量的细胞内冷冻保护剂，如浓度为0.5至3摩尔的甘油和DMSO，可以有效地减少缓慢冷冻细胞/组织中的细胞/组织损伤。

细胞外冷冻保护剂具有更高的分子量，大于蔗糖，不能穿透细胞/组织，如聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基淀粉。这些化合物更有效地保护快速冷却的生物系统，因为它们诱导玻璃化(细胞外玻璃形成)。在某些情况下，胎牛血清(FBS)可以添加到哺乳动物冷冻保存溶液中，但它不是一种冷冻保护剂。

玻璃化

“Vitri”在希腊语中是玻璃的意思，它指的是细胞/组织内形成的玻璃状结构。事实上，玻璃化是液体转化为玻璃的过程，这种凝固是由于粘度的增加而不是结晶。防止冷冻要求组织中的水在冷却过程中保持液态，如果样品被玻璃化，但储存在玻璃化温度或略低于玻璃化温度，就可以实现冷冻。

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冰阻滞剂

有些蛋白质是阻冰剂，因为它们具有抗冻特性;通过与冰晶结合以抑制冰的结晶。人工合成的拦冰剂已经被开发出来，它们可以与“天然”蛋白质和传统的冷冻保护剂相结合，以改善细胞/组织的保存。

冷冻保存介质

合适的冷冻保护溶液可以替代细胞/组织所包埋的生理环境/培养基。缓冲介质应含有特殊的冷冻保护剂，以最大限度地减少冻伤。

在预冷冻阶段，细胞/组织应进行冷却，以减缓代谢，尽量减少缺血和缺氧变化，并降低冷冻保护剂的化学毒性。

样品可以包装在预冷的低温保护溶液0°C至4°C，然后转移到同样预冷的低温保存室。另一种选择是使用可控速率冷冻机。在此阶段，您必须考虑到在生理温度下用于培养细胞/组织的传统组织培养基可能不适合低温暴露。由于热休克，快速冷却可能是有害的，因此在冷却过程中保持组织内的离子和水力平衡可以在设计的介质中更好地控制，以物理上限制这些温度引起的不平衡。最佳溶液必须调节离子平衡，提高渗透压。

如今，如CryoStemTM等现成的解决方案是最可靠、易于使用和最安全的选择。使用这种溶液的一些好处包括:不含蛋白质，适用于各种介质，适用于在喂食器和无喂食器条件下培养的冷冻细胞，并被证明对人类细胞具有很高的回收率。CryoStemTM还含有甲基纤维素和DMSO代替血清，消除了与动物血清和血清衍生产品相关的风险。

有些制剂/细胞可能需要额外的配方。一定要阅读将要使用的试剂的完整描述和建议。

冷却速率

冷却速率可能对细胞存活有显著影响。编程和统一的冷却速率对于有效的长期储存和最大限度地提高细胞/组织的活力至关重要。

冷却速率可控制在4°C至至少-40°C之间。保持所有样品的冷却均匀性也非常重要，一些设备通过内部风扇将液氮注入和分配到腔室中，在运行期间将标准偏差最小化到小于2°C。导致保留细胞活力的最佳缓慢冷却条件是由允许一些细胞脱水而不形成大量细胞内冰的冷却速率来定义的。

对于某些哺乳动物细胞，最佳冷却速率为每分钟0.3°C至10°C。每种细胞类型都有一个冷冻“框架”，其中的冷却速率提供了最佳的细胞存活。

检查设备和冷冻方法

确保你有正确的设备和相应的冷冻方法。

控制速率冷冻设备的主要好处是，为释放潜热而控制速率保存可提高冷冻保存后的细胞存活率。

最常用的方法有:液氮法、温度直接反馈法、定时脉冲法、液氮浸没法或骤降冷冻法以及降压法。液氮是最好的选择之一，因为它具有化学惰性，不易燃，成本相对较低。

直接温度反馈方法通过向室内注入液氮并监测样品温度，同时将实际温度与编程室温度进行比较，并自动调整低压液氮供应，冻结速率或电磁阀故障。

在定时脉冲法中，液氮注入量由阀门通径、罐体压力、阀芯耐磨性和螺线管开口数量决定，由编程的温度冻结速率决定。

在液氮浸泡或跳水冷冻中，样品被装入一个热块，然后这个热块被浸入氮气中。然后，加热器对氮气进行回火，以获得可控的冻结速率。建议用于少量小体积吸管和小瓶。

在Step Down冷冻法中，样品放置在冰箱中过夜，转移到-70°C的冰柜中一段时间，然后转移到氮气蒸汽中。

冻结协议

建议为您的细胞/组织优化冷冻方案，测试不同的时间和温度，以确定获得所需水平的细胞活力或组织功能所需的步骤。所选设备或介质的制造商可能会推荐可能产生可接受的可行性的协议或程序，这是一个很好的起点。

对于2毫升样品大小，通常使用的方案是，从成核到-40°C的速率为1°C，从-90°C结束温度的冷却速率为每分钟10°C。

储存低温保存的样品

根据经验，温度越低，可行的储存期就越长。一些样品可以在-70°C保存数月或数年，但导致细胞恶化的化学反应在此温度下并没有完全停止。温度低于-130°C的样品可以保存数千年。

存储阶段

样品可以储存在气相中，也可以储存在液相中。液相存储提供-196°C的均匀温度。这种方法的缺点是使用的包装材料(低温容器)可能会泄漏并允许液氮进入包装，并且由于氮气在受热时膨胀成气体，除非在回收样品时允许气体逸出，否则可能会引起爆炸。提示:立即打开瓶盖，分散压力，减轻这种威胁。

气相存储提供了一个温度梯度，而不是一个均匀的温度。储存在气相中减少了交叉污染的可能性，但在储存时间方面没有那么多的安全边际。

存储系统或容器

选择最佳容器的四个主要因素是成本(价格、质量、保修)、消耗(如液氮损失率)、样品容量和控制(温度、自动灌装和监控)。

安全和质量控制

由于氮气是无色、无嗅、无味的，所以人的感官无法察觉，有可能引起头晕、失去知觉、死亡。

密封不当的容器可能会爆炸。将容器置于气相氮气中数小时后再浸入液氮中，可将爆炸的风险降至最低。

通过在安全柜中打开容器，可以避免危险样品污染样品和用户污染的风险。

安全建议为防止接触液氮，应佩戴防护面罩、绝缘手套和长袖服装。始终使用低温液体容器，不要密封或防止液氮排放。使用固体棒作为测量棒，只在通风良好的地方使用液氮，不要装满容器。应制订消除污染的方案，以便立即采取纠正措施。经常更新每一个机架，盒子的信息，以及所有的样品信息:类型，日期，负责人等。

恢复协议

其中一个主要挑战是如何让细胞/组织以最佳状态恢复生命。在哺乳动物胚胎的情况下，缓慢变暖对生存是必不可少的，因为它给细胞充足的时间来补充水分和逐渐损失累积的溶质。对于低温保存缓慢升温的细胞，小冰晶核容易通过重结晶生长，造成细胞损伤。细胞能够在快速融化中存活下来，因为它们在快速冷却期间积累了相对较少的溶质，并且在快速升温期间几乎没有机会发生再结晶。以适当的时间间隔逐步稀释冷冻保护剂，以保持细胞体积低于损伤阈值，并在非渗透性溶质(蔗糖)存在下稀释冷冻保护剂，防止溶质扩散出细胞时细胞肿胀。

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