小贴士抗体验证
有抗体验证策略适用于所有应用程序和其他特定于应用程序的。
关键是理解,每个应用程序都必须独立验证,验证跨多个应用程序可以支持,验证功能和特异性的一个应用程序或在另一个模型不能证明验证。
同样重要的是要考虑,没有单一的验证试验比另一个,应该采用多种策略确保特异性和敏感性取决于目标和应用程序被研究。
对于所有应用程序,应使用下面的验证方法:
- 二进制模式:只要有可能,抗体应该测试模型,包括积极的和消极的控制。使用基因或CRISPR / Cas9-based击倒,RNAi-based击倒,内生细胞系或组织与已知的正/负(高/低)的表达目标蛋白质是最好的方法之一来验证抗体特异性。再一次,这种方法应该被应用到每一个应用程序您计划使用。
- 同样重要的是屏幕上你的抗体在细胞/组织面板或数组排除非目标绑定。抗体显示一个精致的特异性模型或物种可能偏离绑定在另一个模型或应用程序——它是重要的来验证你的抗体种类和你打算使用你的实验模型。
- 重组蛋白或转染构造可以用来确认您的特异性抗体,当没有其他模型可用,或验证是否存在大的同源染色体或亚型。这一步尤为重要,如果你正在研究一种蛋白质的目标是高度同源蛋白质的一个家庭的一部分。
- 使用上的两个抗体检测的抗原相同的蛋白质是另一种方法来确定特异性。这种方法最适合于免疫沉淀反应(IP)的实验,你与一个抗体,检测与其他免疫沉淀反应,但可以应用到其他应用程序。理想情况下,这两个抗体应该检测相同的频带通过免疫印迹或本地化同一车厢的细胞或组织。然而,这种技术不应孤立地使用,因为它可能对抗体是错误的或产生稍微不同的结果。
当使用抗体检测转录后修饰(天车),特定站点或者pan-reactive(如phospho-tyrosine),它是至关重要的不仅为目标确定特异性还感兴趣的站点和修改。此外,它是非常重要的,验证抗体仍发现感兴趣的网站/天车在附近的天车的存在可能改变抗原。
- 验证抗体在细胞/组织处理或没有受体激动剂或抑制剂,特别是调节感兴趣的天车在网站上。如果你不确定网站的监管,理解,和下游的一大资源,天车调控蛋白质的信号PhosphoSite +。
- Phospho-tyrosine,尤其是高免疫原性和抗体检测在一个上下文Phospho-tyrosine经常在其他蛋白质和phospho-tyrosines交叉反应。p-Tyr-specific抗体,它是至关重要的验证网站和目标特异性使用多个应用程序和验证技术。
- 比较的能力抗体检测天车与网站的兴趣修改的或PTM-peptide的存在,是一个有用的工具来确认特异性在任何应用程序。应用独立方法如肽elisa(竞争性和非竞争性)也可以用来验证抗体的特异性。同样,使用肽肽数组代表感兴趣的网站上的所有可能的天车和附近的站点,可以用于确定抗体特异性以及附近的铝电解的影响能力的抗体绑定到感兴趣的网站。
- 最后,还可以使用特定的突变体的蛋白质通过正面和负面的突变体来帮助确认的特异性抗体。例如,引入丙氨酸或谷氨酸磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可以用来理解的特异性抗体。这些结果进行解释时应特别谨慎因为抗原表位的任何操作可以废除抗体绑定。然而,这可能是一个有用的工具当没有其他可用(和许多评论家会要求这个实验!)。
验证抗体的特定应用程序依赖于应用程序和上述通用验证方法的结果。例如,在成像的应用程序,确保信号定位到正确的细胞类型或车厢内细胞或组织是至关重要的。
使用受体激动剂或抑制剂诱导易位、表达、降解或其他相对信号非常有用的变化验证你的抗体检测是正确的目标。使用目标的生物学来设计实验,将有助于建立一个验证策略。
enrichment-based应用如IP和芯片,确保知识产权工作使用上述的两种不同的抗体应该是第一选择,但也可以使用不同的,epitope-tagged蛋白质验证抗体在IP化验工作通过使用有针对性的浓缩和标记抗体的抗体检测。如果是装备、IP紧随其后的是质谱也可以用来验证蛋白质浓缩在一个IP。
跨应用程序验证的重要性不能被低估。一个简单的免疫印迹之前使用一个包含IHC抗体可以提供关于抗体的特异性和潜在的非目标交互。然而,这样做正确意味着使用相同的模型,免疫印迹和包含IHC实验。同样,采用免疫方法可以用来证实流式细胞术观察,因为同样的方法修复和染色的细胞。
最关键的是,每个实验都应该包含所有正确的积极的和消极的控制包括实验、加载、和同形像控制根据实验设计和应用程序使用。这样可以确保抗体的功效还实验本身工作独立于抗体的特异性和功能。
