化学改性合成的应用指南为CRISPR-Cas9基因组RNA编辑

细菌CRISPR-Cas9系统已经应用于哺乳动物细胞有效干扰基因通过有针对性的DNA双链断裂的形成。的Cas9 RNA与DNA核酸酶直接使用指南(gRNA),要么是本机dual-RNA系统组成的DNA-targeting CRISPR RNA (crRNA)和trans-activating crRNA (tracrRNA),或嵌合单导RNA (sgRNA)通过融合crRNA和tracrRNA创建的。DNA-free基因组工程可以通过使用Cas9 mRNA gRNA或Cas9蛋白,包括体外转录(溶)gRNA sgRNA合成或合成crRNA: tracrRNA。而溶sgRNAs可以引起免疫反应,合成sgRNA或crRNA: tracrRNA几乎没有影响免疫反应并允许化学修改合并到RNA增加稳定性。我们的化学改性合成crRNA: tracrRNA有1至3个2 -O-methyl和phosphorothioates (MS)在5 '和/或3 '末端。这些修改rna与Cas9 co-delivered进入细胞信使rna或Cas9蛋白使用电穿孔。一些修改模式被发现显著改善CRISPR-Cas9基因编辑Cas9信使rna一起使用时修改的版本相比,然而大多数的修改并没有显著增加基因编辑时使用Cas9蛋白质。转染reagent-mediated交付这些修改gRNAs Cas9-expressing细胞系导致类似编辑修改的合成gRNAs效率,观察和细胞毒性与某些修改模式。的修改是无毒的,有些模式显示在编辑效率有所改善co-transfected Cas9信使rna或Cas9蛋白质。总体而言,我们的研究结果表明,实验所需修改女士co-electroporation Cas9 mRNA和合成gRNA,然而对编辑效率没有影响交付时lipid-based转染试剂。