完成校准标识CRISPR-Cas9基因组非目标使用Edit-R CRISPR特异性工具和位置公差不匹配的综合分析

CRISPR-Cas9系统有潜力推动基础研究和应用研究;然而,RNA-directed DNA的特异性乳沟事件尚未完全理解和可以阻碍其广泛应用。新发现对非目标效应及其决定因素经常被报道。最近的研究表明基因完CRISPR rna (crRNAs)包含的凸起4核苷酸,但是现有的设计工具无法检测的非目标基于缺口对齐。我们现在Dharmacon™Edit-R™CRISPR特异性的工具,一个简单的web工具,利用良好的一致性优化技术进行快速、可定制的、完整的crRNA特异性检查包括缺口检测。的Edit-R CRISPR特异性dharmacon.gelifesciences.com/tools-and-calculators/crispr-specificity-tool工具是免费访问此外,我们已经全面评估位置偏离的倾向CRISPR Cas9系统利用三分量的平台,合成crRNAs,合成tracrRNA。我们执行一个系统的屏幕位置crRNAs包含两个核苷酸不匹配为两个功能crRNAs DNA的目标。应用高通量记者分析,直接措施中央细胞的功能活动过程(ubiquitin-proteasome活动),允许测量相对分裂活动的所有破坏性two-mismatch组合为每个crRNA(190组合序列或380),不管目标地区日常需要自然发生在基因组相邻PAM。我们的研究结果表明,虽然非目标确实发生在两个crRNA和目标之间的不匹配的DNA,功能非目标的总体水平较低相对于目标的活动。分析,进一步阐明了容忍的位置不匹配机制CRISPR-Cas9非目标以及为哺乳动物的基因提供了额外的crRNA设计规则编辑。 These studies demonstrate the simplicity and high-throughput nature of this three-component system for elucidation of CRISPR-Cas9 function and mechanism.