采用三维文化模型可以拯救生命

作者Ronald A. Faris，康宁生命科学细胞生物学主任。

1993年，在一项临床试验中，15名患者接受了9-13周的非阿尿定治疗乙型肝炎感染。7例患者出现严重肝毒性;5例患者死亡(1)。此前未检测到非尿嘧啶毒性在活的有机体内动物研究(2)。

二十年后

药物诱导的肝损伤(DILI)是药物临床和售后失败的主要原因(3)。在药物发现过程中，仍然明显需要生理相关的细胞模型来检测慢性肝毒性。原代人肝细胞是评估药物-药物相互作用和药物安全性的“金标准”，但在单层培养中迅速失去功能。为了解决这个问题，可以将肝细胞培养为称为肝球状体的三维(3D)微组织。三维细胞培养模型更准确地反映了复杂性在活的有机体内微环境。3D培养可延长肝细胞活力，恢复膜极性，并通过促进更多的细胞来增强细胞功能已例如细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用(4)。

进行生理相关的筛选

目前评价药物安全性的方法包括发光活性测定和高含量分析(HCA)。HCA通过同时分析多个细胞参数来监测细胞健康状况。HCA的最新进展使3D微组织的自动化成像成为可能。然而，广泛采用生理相关的细胞模型进行早期毒性筛选，需要一种可扩展的、可重复的、易于成像的3D培养格式。

有许多商业上可用的3D培养格式，包括微芯片、生物反应器、凝胶、支架和无支架平台。超低附着板和悬滴是用于生成形态和功能可比较的肝球的无支架平台。这两种形式都避免了其他模型的一些问题，如潜在的药物与支架材料的结合，凝胶的批量变化和生物反应器的缺乏可扩展性。无支架形式也支持由多种肝细胞类型组成的肝球体的自组装。

康宁生命科学商业技术经理Todd Upton表示:“康宁®超低附着表面球形板(图1)的一个优势是，专利设计可以在单孔中实现均匀的肝球形形成和自动化的多路HCA细胞健康分析。”

图1。康宁®微球板。超低附着表面使均匀和可重复的3D多细胞球体形成。球体可以在同一平板中生成、培养和检测荧光或发光信号。

鼓舞人心的消息

Bell及其同事最近的一份报告强调了肝球形在检测慢性毒性方面的潜在预测价值(5)。这些研究人员证明，在康宁®超低附着表面球形板中产生的肝微组织在化学定义的无血清培养基中保持表型稳定。肝球状体的长期稳定性使研究小组能够使用生理相关的药物浓度进行长达五周的多次剂量毒性研究。肝小球对几种已知的肝毒素(包括菲亚尿定)的慢性作用敏感。特别值得注意的是，3D培养支持所观察到的药物代谢蛋白质组的个体间表型变异在活的有机体内（6）．

康宁生命科学副总裁兼总经理Richard Eglen表示:“这是一个非常令人鼓舞的结果，很明显，3D细胞培养模型将更好地理解药物毒性是如何受到患者遗传倾向和生理状况的影响的。”

未满足的需求

不可预见的药物性肝损伤的发生是由于个体间药物处置的差异。这一事实使得需要一组来自不同供体的肝细胞来模拟人类药物反应的多样性。虽然原代人肝细胞的3D培养能够进行慢性毒性筛查，但原代细胞价格昂贵，供应有限，且细胞质量因批次而异。每一批原代肝细胞都必须经过鉴定。这些限制阻碍了原代细胞用于高通量屏幕的常规使用。

在3D培养中表达完整的肝I期和II期药物代谢酶和药物转运蛋白的替代肝细胞模型将使早期DILI筛查成为可能。几种市售肝模型包括干细胞衍生肝细胞、HepaRG™和康宁®肝细胞。这些细胞模型中的每一个都提供了持续的细胞供应，允许DILI筛选的标准化。

所面临的挑战

在临床试验之前检测慢性肝毒性需要系统地整合生理相关的培养形式、反映基因组多样性的新细胞模型和高通量筛选测定。3D文化格式产生健康的，在活的有机体内-相关的显微组织，并使用临床相关的药物浓度重复给药方案。用原代肝细胞和3D培养检测慢性药物毒性是令人鼓舞的。未来的挑战将是对可再生细胞模型的广泛验证，该模型可识别由药物配置的个体差异引起的特异性毒性。经过验证的3D细胞模型将使DILI在药物发现的早期进行筛查，并有望开发更安全的药物和更个性化的药物方案。

关于康宁肝细胞

图2。从单层培养的不同肝细胞模型获得的细胞毒性数据的分级聚类分析。

康宁肝细胞来源于永生化肝细胞细胞系，并在规定的条件下进行制造和冷冻保存，以确保批次到批次的一致性。暴露于Enzo®生命科学公司的SCREEN-WELL®肝毒性库后，HepatoCells比HepaRG更接近原代肝细胞的细胞毒性特征(图2)。

肝细胞形成均匀的肝球(图3)，当以剂量依赖方式评估时，在3D培养中，与HepaRG相比，肝细胞对几种有毒化合物同样或更敏感(表1)。

表1。通过Promega的Cell Titer-Glo 3D评估Screen-Well肝毒性库中选定化合物的效价分析。N=每浓度8口井。

Ronald Faris博士，康宁生命科学细胞生物学主任。在加入Corning Incorporated之前，他是MultiCell Technologies的首席科学官。他的研究小组目前专注于为ADMET应用开发创新技术和产品。

参考文献

1.McKenzie R, Fried MW, Sallie R, Conjeevaram H, Di Bisceglie AM，等。fialuridine (FIAU)是一种实验性核苷类似物，用于慢性乙型肝炎的肝衰竭和乳酸性酸中毒。

2.Manning FJ, Swartz MN。fialuridine (FIAU)临床试验综述。华盛顿(哥伦比亚特区):国家科学院出版社，1995年。

3.坦普尔。j .新批准药物的安全性:对处方的影响。Jama 387:2273-2275, 2002。

4.Godoy, P, Hewitt, NJ, Albrecht, u等人。使用原代肝细胞、替代肝细胞来源和非实质肝细胞的2D和3D体外系统的最新进展，以及它们在研究肝毒性、细胞信号转导和ADME机制中的应用。Arch Toxicol 87:1315- 1530,2013。

5.Bell, CC, Hendriks DFG, Moro SML，等。原发性人肝细胞球状体作为药物诱导的肝损伤、肝功能和疾病的模型系统的特征。科学报告DOI:10.1038/srep25187, 2016。

6.Wong A, Weinreich J, Wolff A, Sherman H, Gitschier HJ, Randle DH。使用康宁®HepatoCells, Spheroid Microplate和SCREEN-WELL®肝毒性库进行三维肝毒性筛查。(www.enzolifesciences.com)。