表型筛选的进展:药物发现的转折点?

药物发现方法可以大致分为两类:基于靶点的和基于药物的表型筛选．从历史上看，药物是根据其可见的(或可感知的)健康益处而选择的，在20世纪初，系统的表型分析获得了关注。到20世纪90年代末，基于分子生物学几十年进步的靶向药物研发主导了制药行业。

今天，它很容易被发现不满药物发现成功率;尽管有重大的技术进步和不断增加的药物研发投资，但中国的经济增长一直稳定下降在进入临床开发和进入市场的新药数量方面。从2006年到2015年，从I期进展到美国FDA批准的总体可能性仅为9.6%(基于a生物的报告临床开发成功率，n = 9985)。虽然转向靶向药物研发并不是这种低效率的唯一解释，但也有一个原因共识我们过于依赖于对靶标或通路与疾病之间的联系的假设β淀粉样蛋白假设是一个经典的例子)。

在基于靶点的药物发现方法和表型药物发现方法之间的选择并不是一个“非此即彼”的例子，因为现实是介于混乱的中间。然而，现在迫切需要纳入承认生物系统复杂性的研究模型和技术。在这篇文章中，我们探讨了与基于细胞的表型筛选相关的最新发展，讨论了良好的表型药物筛选的要素，并发现这些方法是如何帮助为药物筛选提供更准确的生物学背景的。

什么是细胞表型筛选?

在药物发现的背景下，基于细胞的表型分析是一种复合筛选系统，侧重于调节细胞的表型，在某种程度上与疾病具有生物学相关性。虽然表型筛选主要用于复合筛选，但它也用于一般研究——例如，研究基因敲除和过表达，或比较单个患者样本。以最纯粹的形式，表型筛选在不事先了解其活性或作用方式的情况下，鉴定出能产生理想生物效应的化合物。在实践中，表型筛选项目并不总是目标不可知的，布罗德研究所的一位高级计算生物学家说，贝丝·西米尼博士:“有一个光谱;你可以有一个也有表型成分的目标分析，你可以有一个纯粹专注于一个目标的分析，或者你可以有一个完全没有目标的分析。”

研究人员希望表型筛选能够更好地预测具有治疗价值的化合物，因为可以在模拟疾病某些方面的基于细胞(或基于组织或基于整个生物体)的模型中观察到相关的可测量的变化。表型药物筛选利用核染料、免疫组织化学和其他工具来观察表型变化，如与细胞形态(包括细胞核或其他细胞器)、空间安排(模式和间隔)、特定蛋白质/s的产生、基因表达或细胞死亡相关的变化。有时，疾病的特征并不与易于筛选的表型相对应，而潜在的分子事件则被用于研究代理人．

什么是好的表型药物筛选?

从根本上说，一个好的表型药物筛选最重要的特征是它的可翻译性，即筛选试验预测临床对药物的治疗反应的能力。但这在实践中意味着什么呢?在深入投入临床试验之前，我们如何才能知道一种表型药物筛选是否合适?在2015年,文森特等人。创造了表型筛选“3规则”，并强调了三个特定的标准，以帮助设计最具预测性的表型分析:

• 系统:检测方法与疾病的相关性如何?该细胞是否适合用于检测?
• 刺激因素:刺激因素与疾病的相关性如何?理想情况下，表型分析将使用高度相关的细胞，如合并致病基因改变的患者来源的细胞。如果这是不可能的，“最佳猜测”的努力，如使用炎症或细胞毒性药物来重建感兴趣的细胞损伤。
• 终点:检测读数与临床终点的相关性如何?使用临床终点的小型化版本作为分析读数的分析比那些不接近再现关键的分析更受欢迎在活的有机体内疾病表型。

患者来源的类器官给个性化医疗带来了希望

为了解决更复杂的细胞模型的需求，更好地概括在活的有机体内生理学，一系列的微生理系统已经出现。与二维细胞单层相比，microphysiological系统可以具有关键的生物刺激，包括机械线索(例如剪应力和拉伸)，三维微环境，持续的浓度梯度，以及多种细胞类型之间的相互作用。这些系统(被描述为芯片上的器官、类器官、3D球体和静态微图案技术)使用微工程技术、药物输送和/或传感工具来检测药物和/或微环境对活细胞的影响。人类瀑样是三维多细胞的在体外组织构造作为药物发现和人类特异性疾病机制研究的工具。它们因能够模仿器官的某些功能而受到青睐，并且可以从诱导多能干细胞或供体组织中提取。

肠道瀑样由直肠活检已被用于研究遗传性疾病如囊性纤维化在荷兰Hubrecht研究所的Clevers实验室，研究人员一直在寻求一种侵入性更小的类器官发育方法。利用在囊性纤维化患者尿液中发现的肾细胞，舒根斯等人(2019)报告原发性肾小管上皮样器官的发育，称为“小管样器官”，代表肾单位的近端和远端段。在囊性纤维化中，基因突变雌性生殖道(囊性纤维化跨膜电导调节)基因损害离子和液体运输功能通过一系列上皮细胞。为了证明小管的适用性体外评估治疗效果，分组完成了福斯科林膨胀试验．

Clevers实验室的博士研究生Maarten Geurts解释了该实验如何用于评估类器官中的药物反应:“在健康的肠道类器官中添加Forskolin会在一小时内产生(cftr依赖的)肿胀反应，而这种反应在cf患者衍生的类器官中不存在。我们可以通过监测福斯克林诱导的肿胀反应来测试cftr恢复药物，在这些药物添加到类器官后。由于小管样蛋白对Forskolin的反应类似，并且可以从尿液中提取，因此它们可以作为一种侵入性较小的模型，以患者特异性的方式测试恢复cftr的药物。”

与文森特的“3的规则”保持一致，有一个强大的相关通过cftr恢复药物恢复肿胀反应与个别患者的临床反应之间的关系。Geurts指出，当患者开始服用实验室中确定的潜在有益药物时，该小组对其基于细胞的表型筛选试验的翻译相关性有了信心:

“在我们实验室进行的基于细胞的表型药物筛选试验中，建立信心的最佳方法是直接在患者身上使用潜在的相关药物。我们从一个有不同突变的病人身上提取了类器官雌性生殖道forskolin诱导肿胀试验显示Orkambi ® (lumacaftor/ivacaftor)导致类器官肿胀，提示对患者有有益的反应。在患者开始服用lumacaftor/ivacaftor后，其症状明显减轻，显示我们的在体外表型药物筛选可以直接转化为患者。”

用形态学分析把网撒得更大

对于期望表型未知的疾病，一些人相信基于图像的高含量筛查将提供价值，价值数百万美元合作正在发射来证明这一点。与传统的筛选分析相反，传统的筛选分析专注于量化少量预先选择的特征，形态“分析”撒下更大的网来收集基于细胞形态的见解——这是一个潜在的丰富数据源。随着人们对单一人群平均读数的分析可能产生质量较差的结果的担忧不断增加努力在单个细胞的水平上绘制多个参数并改进图像处理，这在传统上是一个非常耗时的练习。现在，显微镜和图像分析可以自动化，从而实现高含量筛选和较少偏见的分析方法。

的细胞绘画的研究人员共同开发的卡彭特而且以下两麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的实验室，可以从每个染色和成像细胞中产生大约1500个形态特征。测量的特征被整合到形态剖面中，包括染色强度、纹理模式、大小和8个标记细胞器的形状，以及跨通道染色之间的相关性，以及细胞间和细胞内结构之间的邻接关系(图1)。虽然大多数已发表的分析方法仅使用3种染料，但细胞绘画法使用6种荧光染色在5个通道成像。

图1。具有特定细胞器的图像样本，从单细胞绘画试验中提取(右下)。图片由布罗德研究所的Cimini博士提供。

西米尼共同领导开发CellProfiler ™ 这是一款用于形态特征提取的免费开源细胞图像分析软件，并指出，“表型分析的最大优势在于能够廉价、轻松地进行分析，然后能够建立关联。”这些关联可以用来选择从更集中的筛选方法中受益的化合物。在这一点上，西米尼强调了研究其中，单个高通量成像分析的数据被重新用于预测其他(更昂贵或低通量)分析中化合物的生物活性，将命中率提高了50- 250倍。

我们正在见证一个转折点吗?

作为总结最近遗传学家阿德里安·伯德爵士说，“生物学已经成为一块巨大的画布”——表型筛选也不例外。表型筛选工具包继续扩大，从微生理系统和形态分析，到基因编辑技术重现疾病状态在体外,基于图像的机器学习模型根据嵌入在图像中的表型特征来预测化合物活性。希望，我们将回顾这段时间作为一个转折点，在药物筛选过程中提取更多生物学相关信息的努力转化为提高临床成功率。