单细胞测序及其应用研究进展

细胞群并不像研究人员曾经认为的那样统一。单细胞基因组DNA测序提供了对样品中可能存在的不同种类细胞的深入了解。即使在基因相同的细胞中，RNA的单细胞测序或表观遗传修饰也可以揭示重要的细胞多样性。在这里，我们将介绍单细胞测序的最新进展及其在肿瘤学和微生物学等不同领域的应用。

单细胞测序是如何工作的

在单细胞测序技术出现之前，使用的是批量测序。然而，当组织中的细胞批量测序时，稀有细胞会被稀释和平均掉。单细胞测序在生物学研究中非常有用，因为它可以使稀有且无法培养的细胞得到鉴定。此外，它有助于理解复杂样本中的细胞异质性。

单细胞测序的过程包括几个主要步骤:当样本是组织时，需要将组织解离成细胞悬浮液。 ¹ 如果样品已经作为细胞悬液存在，则可以原样使用。接下来，利用微操作、流式细胞仪分选或微流体技术将目标细胞捕获为单细胞。使用微移液管的微操作技术是最便宜的，但也是最费力的，而半自动化微流体技术在液滴中进行单细胞包封正变得越来越流行。分离的单个细胞被裂解以捕获尽可能多的DNA或RNA分子。接下来，对于单细胞RNA测序(scRNA-seq)， RNA在进行PCR扩增之前通过逆转录转化为互补(c)DNA。然后准备DNA或cDNA文库，并通过下一代测序技术分别进行基因组和转录组测序。最后，采用生物信息学方法对数据进行分析。

单细胞测序是一个快速发展的领域。尽管工作流程已经明确，但更好的生物信息学工具正在不断开发，以生成更可靠的细胞聚类数据。此外，单细胞测序也被广泛应用于从环境分析到癌症治疗的科学问题。

通过整合来自批量和单细胞测序的数据来改进分析

每种类型的单细胞测序方法都提供了独特的信息来破译复杂细胞群中的异质性。例如，单细胞RNA、转座酶可达染色质(ATAC)测定和染色体构象(Hi-C)测序分别提供了基因表达谱、可达染色质区域和染色质接触的信息。然而，即使有单细胞RNA和ATAC实验，如果我们不能将活性调控元件和基因启动子之间的3D接触连接起来，我们对特定调控网络的理解是不完整的——这是批量测序提供更好信息的领域。

Zeng及其同事介绍了一种名为DC3(去卷积和耦合聚类)的新方法，用于改进批量数据和单细胞数据的联合分析，能够将批量数据反卷积为子种群特定的配置文件。 ² 作者应用他们的DC3方法对维甲酸诱导分化4天后的小鼠胚胎干细胞进行scRNA-seq、单细胞ATAC测序(scATAC-seq)和大量染色质免疫沉淀(Hi-ChIP)联合分析。

DC3确定了三个亚种群。作者重点研究了同时表达EpCAM和CD38表面标记的亚群2，并且与其他亚群有明显不同。接下来，他们进行了Hi-ChIP实验，从环图的主分析成分图中，双阳性(EpCAM+CD38+)样本与亚群2细胞的Pearson相关系数(PCC)为0.7633，显著高于亚群1和3细胞的Pearson相关系数。这证明了DC3在复杂生物样本中批量循环数据反褶积的有效性，可以更好地使用单细胞测序数据对细胞类型进行分类。

将DC3方法应用于基因本体富集分析，Zeng和同事们还发现含有细胞体积环剖面的DC3比单独使用scRNA-seq数据提供了更好的富集结果。具体来说，当测序深度(即基因组中核苷酸被读取的次数)较低时，dc3推断的环信息比单独的scRNA-seq数据提供了更好的亚群体特征描述。这使得DC3成为一种强大的方法，因为它可以通过执行额外的简单且成本不高的HiChIP实验来改进现有单细胞RNA和ATAC测序数据集的解释(特别是那些测序深度低的数据集)。

多重单细胞测序了解癌症异质性

患者样本中存在肿瘤内异质性，这可能是治疗效果差异的原因。Kinker和他的同事们想要弄清楚这些差异是肿瘤自身微环境还是细胞固有可塑性的结果。“特别是，我们想知道在患者样本中看到的多样性在‘传统’细胞系中复制得有多好，”他说 伊塔Tirosh 他是魏茨曼科学研究所的首席研究员。

利用多路单细胞测序，他们试图研究来自癌症细胞系百科全书(CCLE)的大量细胞系中的细胞多样性。 ^3. 研究小组利用scRNA-seq-对聚集的细胞系进行测序，然后根据体RNA/基因表达和单核苷酸多态性将它们计算为簇。这种方法效果很好，98%的细胞的细胞系分配是一致的。有趣的是，作者发现细胞系培养，甚至共培养，都没有显著影响表达模式，这表明内在的细胞可塑性很可能与培养的时间周期无关。

为了识别细胞的离散亚群，作者使用了各种计算技术，包括t分布随机邻居嵌入和基于密度的聚类，并定义了一个新的术语-“循环异构程序(RHP)”。-通过增强细胞特征基因的功能来聚集细胞。

RHP已被证明对细胞系分类有用。例如，与上皮细胞到间充质转化(EMT)相关的RHP在黑色素瘤细胞系中表现强烈。RHP分类也有助于确定药物敏感性。作者筛选了约2200个抗高上皮衰老程序(RHP之一)细胞的生物活性分子，并表明这组细胞对抗衰老药物敏感，可预测临床药物反应。

“通过我们的研究，我们发现在患者样本中看到的大部分异质性确实可以在传统细胞系中建模，并且我们确定了最佳的细胞系模型。我们还能够描述许多不同的细胞异质性“程序”，这些“程序”在许多细胞系中都有，因此代表了某些癌症的共同特征。其中一些项目具有生物学和临床意义，比如EMT对转移很重要，我们发现衰老项目可以预测对治疗的反应。”“在未来，我们希望使用已确定的模型系统来跟踪肿瘤内异质性的特定“程序”，进一步测试它们的调节和药物反应。”

海洋微生物组的单细胞基因组学(DNA)测序

“海洋微生物在地球化学循环、养分再矿化和气候形成中起着至关重要的作用;它们组成了地球上最大的微生物群之一，并已通过元组学方法进行了广泛的探索。 Ramunas Pachiadaki 他是毕格罗海洋科学实验室的高级研究科学家。

然而，基于培养的微生物学方法无法捕捉环境微生物的多样性。现有的参考基因组仅占海洋宏基因组的0.4%。缺乏更好的参考基因组是了解我们环境中的微生物组的一个限制因素。

Pachiadaki和他的团队表明，单细胞基因组学是一种强大的、替代的方法，用于微生物基因组的培养无关表示。 ⁴ 他们从28个不同的现场样本中生成了一个大规模的、随机的海洋浮游细菌和古细菌的单扩增基因组库，并对其进行了测序，其中包括在地球化学循环和气候形成等方面发挥重要作用的原核浮游生物。这些样本横跨热带和亚热带纬度的表层海洋^oS到40^oN。

“我们的数据集在大规模和随机、无偏性的细胞选择策略方面都不同于早期的单细胞基因组学项目，这使得它适合于对研究的原始假设不可知的定量数据挖掘。”

从他们的样本中，研究小组生成了一个名为全球海洋参考基因组(GORG)热带的数据集，并发现大多数平均核苷酸识别值小于80%，这表明很少有原核浮游生物是相关的。这是基于94-96%的平均核苷酸鉴定值的标准，微生物物种被注释为相关。

GORG热带文库虽然只包含大西洋和太平洋的样本，但平均代表了全球原核生物多样性的40%。特别是，作者从印度洋中发现了强大的宏基因组片段，这支持了微生物可以纵向分散在海洋中。

该团队继续从样本中测序完整和接近完整的16S rRNA基因序列，产生了令人惊讶的分类分配。大多数流行的原核生物谱系具有小的基因组(1 - 2兆碱基对(Mbp))，低GC含量(29-35%)和小的细胞直径(0.2-0.5 mm)，这与以往的报道一致。然而，也有很多血统是这样的不符合这一模式，因为它们具有平均的基因组大小(>3 Mbp)， GC含量>45%，细胞直径>0.4 mm，这表明它们具有专门的生态位和不同的适应性。

与最近的一份报告相反，Pachiadaki和他的同事们也没有在任何被分析的原核生物中发现固氮途径的证据，包括Planctomycetes门的成员。戈尔格-热带库还提供了生物合成途径的线索，包括含有多种聚酮合酶系统的物种，这些系统已显示出作为天然产物抗生素的效用。 ⁵

“我们在这里采用的方法使第一次系统地、谱系解析地调查了涉及能量、氮和次级代谢的基因簇。这证实了一个早期的发现，基因组潜力的好氧无氧光合作用Ca．并显示了这一谱系Alphaproteobacteria比之前想象的要丰富得多。所鉴定的生物合成簇的丰度和多样性表明了次生代谢产物在自由生活的原核浮游生物稀环境中的重要性，并为生物技术应用提供了生物勘探的路线图。我们还建议，随机单细胞基因组学应该作为研究土壤、植物、哺乳动物和其他微生物群落的一种新的工具性方法，以填补我们对这些重要微生物在不同生态系统和大型生物的功能以及气候变化和其他全球过程中的主要知识空白。 Pachiadaki。

“我们目前正在使用获得的GORG-Tropics数据库来分析海洋微生物中基因交换和病毒感染的全球模式。我们还将GORG项目扩展到黑暗海洋——阳光照射表面以下的水柱——这占整个海洋体积的90%，在很大程度上仍未被探索，”他总结道。

引用:

1.Haque A, Engel J, Teichmann SA, Lönnberg T.生物医学研究和临床应用的单细胞rna测序实用指南。基因组医学．2017; 9(1): 75。doi:10.1186 / s13073 - 017 - 0467 - 4．

2.曾伟，陈旭，杜仁中，王勇，蒋锐，王文辉。DC3是一种从大量和单细胞基因组数据进行反褶积和耦合聚类的方法。自然通讯．2019; 10(1): 4613。doi:10.1038 / s41467 - 019 - 12547 - 1．

3.金克尔，郭志强，李志强，等。泛癌单细胞RNA-seq识别细胞异质性的重复程序。自然遗传学．2020; 52(11): 1208 - 1218。doi:10.1038 / s41588 - 020 - 00726 - 6．

4.李志强，李志强，等。通过单细胞基因组学绘制海洋微生物组的复杂性。细胞．2019, 179 (7): 1623 - 1635. - e11。doi:10.1016 / j.cell.2019.11.017．

5.Karpiń滑雪TM。具有抗菌和/或抗真菌活性的海洋大环内酯。3月的药物．2019; 17(4): 241。2019.doi:10.3390 / md17040241．