改进抗体-药物偶联物的表征

抗体-药物偶联物(adc)是一种新兴的治疗方法，由与小分子药物相连的单克隆抗体组成。将细胞毒性作用靶向于一部分细胞，同时保留其他细胞的能力，使其成为癌症等疾病的一种有吸引力的治疗选择。然而，adc的分析——临床前开发和质量控制的关键步骤——可能很困难，需要改进分析方法。

在一个新的研究结果发表在分析化学来自威斯康星大学的科学家展示了一种新的基于质谱的方法，可以实现adc的高通量表征。

188金宝搏备用伊莱·j·拉尔森(Eli J. Larson)是这篇论文的主要作者，也是美国科学院的博士候选人通用电气实验室，以了解更多关于该方法的信息，以及它比现有分析技术提供的一些好处。在这次采访中，Eli还解释了adc如何应用于抗癌治疗，并强调了在确保其安全性和有效性时面临的主要挑战。

Ash Board (AB): adc是如何应用于抗癌治疗的?它的主要好处是什么?

伊莱·j·拉尔森(EL):此时，adc在抗癌治疗中最常见的应用是作为最后的药物。目前FDA批准的11种adc中有10种用于治疗对传统抗癌疗法无反应的患者或复发或难治性癌症患者。adc是小分子药物和单克隆抗体(mAbs)两个治疗部分的结合。小分子药物表现出高水平的细胞毒性，有效地杀死癌细胞;然而，它们经常对患者产生有害的副作用。相反，单克隆抗体表现出比小分子药物更低的细胞毒性，但单克隆抗体的靶向性限制了患者的副作用。将这些部分组合在ADC中，可以保留两种治疗实体的优点，同时减少缺点，使ADC成为抗癌应用的“灵丹妙药”。

AB:在确保adc的安全性和有效性方面有哪些挑战?

埃尔:adc分析的两个关键挑战是adc的分子复杂性和大小。任何基于抗体的治疗都必须评估无数已知的影响药代动力学、结合疗效和稳定性的因素。这些包括初级序列变异，c端赖氨酸剪切，去酰胺化，糖基化变异，氧化和许多其他。由于不同的药物-抗体比(DAR)，随机药物偶联引起的药物位置异构体，以及可能在单克隆抗体的非预期区域(如互补决定区)偶联，药物偶联过程增加了复杂性。对于使用质谱(MS)检测的分析，给定分析物的信噪比随着分析物尺寸的增加而减小。ADC是相对较大的分子实体，质量约为150 kDa，这使得ADC的分析变得困难，特别是阻碍了ADC低丰度变体的检测。

AB:有哪些常用的方法来评估adc的质量属性?这些方法有什么缺点吗?

埃尔:最常用的ADC分析方法是自下而上液相色谱耦合串联质谱(LC-MS2)和中下LC-MS2。自下而上分析使用蛋白酶(如胰蛋白酶或Lys-C)进行广泛酶切，在LC-MS2分析之前产生ADC的肽片段(< 3 kDa)。自下而上的消解过程通常是一个耗时的隔夜反应，并可能在消解和样品制备过程中对ADC进行人工修饰。此外，修饰肽和未修饰肽之间的电离效率差异使得全球分子特征的定量-如糖型变异和平均DAR -难以实现。中向下LC-MS2提供了比自下而上更全面的视角，选择使用特定的蛋白酶如IdeS或KGP进行消化，然后进行化学还原以产生约25 kDa大小的亚基。这使得LC-MS可以方便地定量整体修饰变体，如糖型和平均DAR，但样品制备时间和LC-MS2分析时间仍然约3小时。其他方法，如疏水相互作用色谱法与紫外检测器耦合，可以从完整的ADC中测定DAR，从而避免了冗长的样品消解过程，但缓冲液条件与ms不兼容，并且不容易监测进一步的质量属性。

AB:你们的小组开发了一种快速、高通量的半胱氨酸adc多属性分析方法。你能解释一下这是怎么做到的吗?

埃尔:设计这种方法时，我们的目标是开发一种ADC的快速诊断方法，以通知用户是否需要进一步的ADC表征。为了使该方法真正快速，我们需要:1)减少或消除样品制备时间，2)减少或消除前端分离所需的时间，3)提高质谱灵敏度和信噪比(S/N)， 4)增加质谱分析过程中收集的信息宽度。为了实现这一目标，我们选择了自上而下的质谱分析，这种方法在MS分析之前不使用酶解，从而消除了对样品制备时间贡献最大的单一因素。由于模型半胱氨酸连接ADC完全由非共价相互作用结合在一起，以达到特定的DAR值，我们唯一的样品制备步骤是在非变性，ms兼容的缓冲液中稀释ADC。为了在MS之前消除LC的需要，我们使用了捕获离子迁移率光谱(TIMS)形式的气相分离。TIMS允许测量分析物的碰撞截面(CCS)，并通过改进的信噪比提高灵敏度。与传统方法相比，TIMS的使用已经增加了收集信息的广度，增加了源内碰撞诱导解离(CID)和碰撞细胞CID能量，从而能够检测完整的ADC质量(MS1)、完整的ADC亚单位质量(MS2)和主序列分析(MS3)。与传统方法相比，TIMS结合三层质谱方法提供了更广泛的信息，特别是通过收集完整的ADC质量和确定ADC的CCS值。虽然以前的技术可以提供比我们开发的方法更大的主序列覆盖范围，但我们的技术为用户提供了所需的信息，以确定是否需要更长的分析方法。

AB:与用于分析adc的现有分析技术相比，这有什么好处?

埃尔:与传统技术相比，我们的方法的主要优点是分析速度快，提供的信息广泛。虽然以前的技术使用了漫长的消化过程和一到两个小时的LC-MS，但我们的方法可以通过简单地将分析物稀释在ms兼容的缓冲液中，如乙酸铵，使分析占空比功能上等于仪器分析时间。与传统方法相比，传统方法将CCS和完整的ADC质量添加到亚单位质量和主序列表征中，可以在更短的时间内获得更广泛的信息。我们的方法的一个独特的小优势是使用一个未经修改的，商业上可用的仪器。该仪器广泛用于自下而上LC-MS2分析，我们的方法表明，该仪器的功能比许多用户可能意识到的要大得多。

AB:在临床前和临床后的质量控制中，这种方法如何用于抗体治疗的特性描述?

埃尔:该技术可用于临床前和临床后质量控制，以快速监测基于抗体的治疗方法的批次到批次的可变性。该方法产生的结果提供了治疗属性的路线图，向从业者显示是否需要进一步的分子细节。我设想有一天这种方法可能会用于在线连续生物处理工作流程，这要归功于它提供的速度、信息的广度以及与自动化样本处理设备的易于接口。

Eli J. Larson接受了技术网络编辑主任Ash Board的采访。188金宝搏备用