质谱仪技术推动生物制药工作流程的创新
维姬·格拉泽
随着更高的分辨率、分析速度和准确性，新的质谱技术和技术正在渗透到生物制药的工作流程中，从生物标志物识别到新药靶点发现的应用，到分子活性的验证，以及下游的制造和质量控制。快速增长的生物仿制药行业也利用了分析能力，以及为生物制药应用设计的日益自动化和易于使用的MS系统。
在最近的ASMS年会上，赛默飞世尔科技公司专门针对生物制药领域推出了Q Exactive™生物制药MS/MS混合四极杆-轨道rap质谱(MS)系统。高分辨率的Orbitrap质量分析仪可以对完整的生物分子(如单克隆抗体)进行质谱分析，并在其原生状态下分析抗体糖型，Thermo Scientific的生命科学MS营销总监Jonathan Josephs博士告诉我们。该公司在开发生物制药系统时为Q Exactive添加了第三种扫描模式:高质量范围模式，提供同位素分辨率，并在原生和变性条件下进行完整的蛋白质分析。现有的两种扫描模式可以进行亚基和上/中-下分析或肽映射。为了在天然质谱条件下使用完整蛋白分析来表征治疗性单克隆抗体，Q Exactive质谱可以与使用Thermo Scientific的Vanquish™UHPLC系统和MAbPac™SEC-1柱的尺寸排除色谱相连接。
验证序列，结构，糖和键
Bruker Daltonics生物制药业务部副总裁Bob Galvin博士指出，在分析蛋白质、多肽、单克隆抗体和基于核酸的治疗方法方面，从质谱的角度来看，电喷雾电离(ESI) MS是行业的主要技术，ESI四极飞行时间(QTOF) MS是各种生物制药应用的成熟技术。然而，尽管ESI仪器对某些任务更好，他指出“MALDI系统正变得越来越相关，可以解决ESI无法解决的一些互补分析双药问题。”作为例子，Galvin博士描述了MALDI工作流程，用于IdeS消化形成的单克隆抗体(MAb)亚基的全序列确认和翻译后修饰(PTM)分析，其约为23-27 kDa，或确定经常发生在单克隆抗体中的二硫键跳变。
通常采用自底向上的方法来分析一个完整的150 kDa单抗的结构，使用胰蛋白酶消化将分子分解成更小的肽，通常可达6 kDa。胰蛋白酶消化可诱导假体形成，如脱酰胺或置乱，使得从多肽中推断出原始单抗的准确图像变得困难。
为了克服这些挑战，他说，科学家们正在转向将ESI-QTOF质谱与酶的使用相结合，这些酶可以从消化的单抗片段中产生更少的片段，例如Genovis AB的FabRICATOR®酶。它在重链和轻链相遇的铰链区域切割一个IgG分子，产生三个片段:Fc/2、Fd和LC片段。这种酶不会产生任何伪影。
Galvin博士表示，Bruker的maXis II ETD QTOF系统具有电子转移分离(ETD)功能，具有在线液相色谱速度下的分辨率和准确质量，可以分析形成的27 kda亚基并找到单同位素质量。他说:“确定所有三个单克隆抗体片段的单同位素质量对表明你有正确的结构有很大帮助。”此外，结合ETD和CID片段信息的自上而下蛋白质组学方法可以获得每个片段约80%的序列覆盖率，而使用互补的MALDI-TOF/TOF质谱，“我们几乎总是可以验证每个片段的100%序列，”Galvin博士说。
此外，一个可以测定单同位素分子量的系统也可以检测到27 kDa亚基中小于1个质量单位的微小但重要的变化。生物制药公司可以利用这种能力来监测单克隆抗体内发生的变化，例如量化去酰胺化程度。“脱酰胺是一个非常重要的关键质量属性，因为它会影响功效和稳定性，从而影响产品的保质期，”Galvin博士补充道。
脱酰胺筛选-基于高效液相色谱分离得到的轻链双态的前端和尾部平均扫描的光谱解释Dmass = +0.992 Da
一)阿杜单抗原生键的图形表示。圆的大小表示相对于所有dsb的相对强度。圆圈中的“N”表示它是“原生”键。
生物仿制药需要强化表征
沃特斯生物制药业务发展总监John Gebler博士告诉我们，开发生物类似药的竞赛已经引起了世界各国生物制药公司的注意，并正在催化对MS技术的兴趣不断增长，不仅在西方世界，而且在发展中地区也越来越多。从工作流程的角度来看，尽管像沃特斯这样的公司可以提供基本上端到端的LC-MS工作流程，但该技术仍然相当复杂，需要一定的技能才能有效使用。
他表示:“(我们的客户)希望简化这项技术的运行能力。”总的来说，客户告诉沃特斯，他们希望将MS作为一种工具来获得他们需要的答案。他们主要对结果感兴趣，而不一定对更多的特性和选项或干预自动化工作流和执行更高级别功能的能力感兴趣。他们面临的最大瓶颈之一是如何解释和利用现代MS样本可以生成的大量数据。为了减少人工干预和人为错误，并确保一个定义良好的工作流程，人们希望更多地实现自动化，“希望信息学能够在后端解释数据，”Gebler博士说。
生物仿制药的开发需要对创新产品和生物仿制药进行广泛的分析表征。质谱技术可用于获得复杂生物药物(如多肽)的直接测量。MS数据支持序列确认，结构分析(例如，二硫键的数量和位置)，以及翻译后修饰的鉴定和定量(例如，糖基化模式)。格布勒博士将这一领域描述为“一个移动的目标”，部分原因是技术的不断发展和监管要求的不断变化，因为当局在生物仿制药提交方面获得了更多的经验。此外，创新药物的开发人员在药物的整个生命周期内修改和改进他们的生产工艺，至少在一定程度上增加了生物仿制药行业的难度。
格布勒博士说:“人们认为重要品质的清单正在增加。”对药物化合物进行更深入的表征，识别更多、更多样化的生产中必须满足的关键属性，可以提高生产工艺的可重复性。它还可以帮助企业加强围绕创新药物的知识产权，并提供更好的保护，抵御来自生物仿制药的竞争。由MS技术实现的生物制药的更加密集的表征正在帮助推动这一趋势。
Gebler博士还描述了在生物制药生产的QC阶段越来越多地使用MS技术的趋势。他说:“企业越来越擅长观察和控制自己的流程，但他们不知道如何直接审视自己的产品。”随着从批处理到连续制造的趋势，公司希望能够尽可能实时地监控他们的产品，并查看每个样品中的多个属性。
“质谱在QC中的应用是一个热门话题，”格布勒博士说，“在生物制药领域，目前正在进行一场非常健康的讨论，关于需要什么水平的质谱——简单的或高分辨率的系统——以及哪些信息是可取的和有意义的”，这涉及到理解和改进制造过程。他解释说，这与生物仿制药尤其相关，因为目前没有明确的“相似”定义，也没有明确的生物仿制药与创新产品的区别。
生物标志物的验证
质谱技术在生物标记物的鉴定和验证中发挥着越来越重要的作用，用于生物制药药物开发。生物标记物被用于推动新药物靶点的发现、确认靶向分子的活性、检测脱靶效应和监测治疗反应。它们也正在成为临床研究的关键工具，以帮助选择临床研究的患者，了解药物反应，并为精准医疗开发个性化疗法。
Agena Bioscience™描述了其MassARRAY®系统的各种基于基因组学的应用，用于执行MALDI Tof MS，包括实体肿瘤和液体活检的癌症分析，用于测试ADME基因和评估药物诱导并发症的风险，以及临床研究。例如，在药物基因组学中，MS为基因分型提供了微阵列或下一代测序的替代方案，以识别与对药物化合物更大可能的敏感性或耐药性相关的单核苷酸多态性(SNPs)。Chen等人使用Agena Bioscience MassARRAY系统对非小细胞肺癌患者的样本进行基因型分析，检测出先前与铂基化疗反应相关的8个基因中的13个SNPs (Oncotarget 2016;7[34]:55741-55756)。研究人员在两个基因中发现了特定的多态性，这些基因与对铂基化疗的更大敏感性或耐药性有关。
在另一个例子中，质谱被用于识别乳腺癌患者辐射诱导纤维化风险的生物标志物。Weigel等人在最近发表的一篇文章中指出，该生物标志物也可以作为预防高危患者纤维化的治疗靶点(Nature Comm 2016;doi:10.1038/ncomms10893)。作者使用MassARRAY技术进行了差异全基因组DNA甲基化分析，比较了来自接受放疗的乳腺癌患者的原代人皮肤成纤维细胞，这些患者中纤维化发生或未发生。结果特别指出了含有两个不同甲基化位点的激酶基因增强子的纤维化相关低甲基化。治疗前确定该部位的甲基化状态有助于预测纤维化风险并指导个体化给药。一种旨在阻断受影响的激酶的药物可能会阻止放射治疗的促纤维化作用。
结论
MS技术提供了在基础研究环境之外不容易获得的分析能力，通过能够使用仪器来表征生物分子候选药物的熟练操作人员，它慢慢地进入了生物制药实验室。随着MS行业设计越来越自动化，用户友好的系统，软件管理和解释产生的大量数据，焦点集中在分析复杂生物制药的质谱上。特别是在蓬勃发展的生物仿制药行业，MS是一种越来越有价值的分析工具。
