原生质谱分析:一瞥生物学的阴谋

原生质谱(Native MS)是指通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)将生物大分子及其复合物从三维的、功能存在的冷凝液相转移到气相的过程。可能发生这种情况的实验条件非常温和，以至于非共价相互作用、分子/复合物的原生状态以及相关的生物作用和功能在很大程度上得以保留。从历史上看，原生MS年龄在27岁左右;20世纪90年代初，文献中首次出现了关于非共价复合物的开创性研究。^1、2这项初步工作受到了研究人员的密切关注，如Joseph A. Loo(加州大学洛杉矶分校),卡罗尔·v·罗宾逊(牛津大学)。这些科学家的共同研究为原生MS作为结构生物学的未来方法播下了最初的种子。他们早期的出版物集中在蛋白质-蛋白质相互作用^3.；protein-ligand情结;^3、4分子伴侣GroEL质谱;⁵核糖体等纳米机器;⁶甚至是完整的病毒。⁷

由创新者领导的阿尔伯特·j·r·赫克，本土MS不断成长、发展和完善;特别是在质量分辨率和灵敏度方面。^8、9赫克反思了他追求MS作为一种确定蛋白质结构的技术的灵感:“达德利·威廉姆斯(Dudley Williams)在一次演讲中，用NMR测量了万古霉素与多肽的相互作用。虽然成功了，但这种方法并不容易;我想，也许这样的问题可以由MS来解决?”这个概念引起了赫克的注意，并引导他早期对原生生物MS的兴趣;后来，推动了方法论的质量极限。下图显示的是原生MS从早期开始到今天的显著演变。

本土质谱法的发展。从早期的小蛋白质开始;直到今天完整的病毒颗粒和噬菌体的超分子复合物。图片由荷兰乌得勒支大学赫克实验室提供。

关于原生MS有很多麻烦

原生质谱是一种非常有用的方法，可以深入了解蛋白质在生理条件下的行为。通过利用MS等分析技术，并将该技术应用于生物学情况，更容易掌握细胞中分子水平上发生的情况。虽然这是一种受控的、有些做作的方法，但原生MS仍然高度反映了自然在活的有机体内分子或复合物的状态因此，在结构-功能关系方面产生了更有意义的信息，然后可以与分子建模结合使用，例如，在药物设计等方面。

从根本上说，原生MS是一种可以提供生物学背景的精确技术。本土MS的鼻祖之一Joseph A. Loo告诉我们:“想想看……大多数生物大分子的功能是由它们形成的相互作用决定的。最近的人类“相互作用组”研究表明，每种蛋白质的平均相互作用体数量约为10个。这是基因组编码的每个蛋白质的正常功能的一部分。”他相信原生MS有潜力提供一种直接研究这种相互作用的方法，这些相互作用是蛋白质功能的驱动因素，并且相信随着更多的研究人员采用原生MS，新的令人兴奋的应用将会被常规报道。

原生MS的成功取决于两个关键因素

为了可靠地进行原生MS实验，必须解决一些关键标准以确保成功。第一个标准是包含感兴趣的原生复合体的解的性质。为了保持结构完整性和防止降解，大多数蛋白质复合物储存在生理相容的条件下。从本质上讲，这意味着在缓冲液中不挥发，含有盐，表面活性剂和其他稳定剂，通常不兼容电喷雾电离过程。对于大多数蛋白质组学应用，不需要保持复杂的完整性和非共价相互作用。因此，变性条件是通过添加破坏大分子复合物的任何预先存在的三维结构的剂来展开蛋白质。

因此，通过MS观察完整的天然蛋白质复合物的基本要求是将通常的生理缓冲液交换为挥发性的氨基半缓冲液，不仅保持相互作用的完整性;但也与ESI过程中将分子从液相转移到气相所需的脱溶过程兼容。实现这些基本原理并不总是简单的，正如Loo所指出的:“正确的样品制备仍然是许多实验室面临的最大障碍之一。”此外，他继续说:“这通常取决于样本，所以一种样本的处理方式可能不适用于另一种样本。”尽管他承认在过去10年里已经取得了重大进展，而且供应商现在正在提供可行的解决方案来解决样品制备问题，“这仍然是该领域的一个重大问题。”

其次，由于蛋白质复合物处于自然折叠状态，获得电荷的可用位点数量减少，因此质谱中可见的电荷态数量也减少。缺点是这些大的超分子配合物具有非常高的质量电荷比(m/z)，通常超出了标准质谱仪的质量范围。为了进一步发展本土MS，重要的是开发具有先进物理特性和功能的仪器。由Standing, Robinson和Heck领导的四极飞行时间(QTOF)质谱仪是分析大分子组装的首选仪器。^{5- 7,10,11}

2012年，亚历山大·a·马卡罗夫(Alexander a . Makarov)和赫克实验室合作，在轨道rap质谱仪上报告了原生质谱的进展。⁸整个仪器都进行了修改，从而提高了高m/z范围内的离子性能。此外，还讨论了高分辨率的重要问题，例如，分子质量增加<总质量的0.1%的基线分辨率峰值，以及灵敏度。在这方面，Loo评论道:“今天，质谱仪已经专门为原生MS设计和优化，许多研究人员很好地理解如何操作仪器以最大化性能。这仍然不是常规，但它肯定会达到!”

本机MS应用程序的无与伦比的多样性

问题可能不是什么时候可以使用原生MS;而是什么时候不能使用它?今天，应用是广泛和多样化的。在蛋白质组学中，原生MS非常适合于观察和分析非共价生物分子复合物。实验系统包括:完整蛋白质的研究，包括评估混合物中的蛋白质异构体和定义翻译后修饰;完整蛋白质/亚基折叠动力学;完整蛋白质构象及构象变化;蛋白质复合物和化学计量学(特别是野生型和突变型);蛋白质复合物组装态;生物活性复合物和确定蛋白结合亲和常数。 Furthermore, other areas of key interest include observing and understanding conformational changes that occur in proteins (or DNA/RNA) when a complex is formed with a small molecule (such as a drug or metabolite) and/or nucleic acids.

小分子-蛋白质相互作用一直是学术界和制药业的兴趣所在。Loo是第一个理解该领域原生MS应用程序的力量的人之一。在学术界逗留期间，他意识到:“原生MS可以用于进一步的药物发现工作，因为小分子药物通常针对蛋白质。因此，天然MS可以用来表征蛋白质-药物复合物，并帮助开发更有效的药物化合物。”

随后，原生MS进入生物技术和生物制药部门，预示着这一重要技术从学术研究工具向更常规的应用过渡。除了对小分子发现和开发的持续兴趣外，该部门在蛋白质治疗方面也有既得利益。因此，必须采用一种可靠的方法来表征基于抗体的免疫偶联物、生物仿制药和抗体-药物偶联物。正如Heck所说:“虽然原生MS年龄在20到25岁之间;直到最近，它才成为制药公司工具箱的一部分，行业内的接受度正在迅速扩大。”对此类产品中杂质和/或团聚物的质量控制评估对于获得管理当局的批准至关重要。

例如，在非变性条件下分析样品，不仅可以确定产物的分子质量，还可以提供有关同质性、构象(折叠与展开)和寡聚状态的宝贵信息;所有这些都是生产高质量产品的关键因素。此外，在天然条件下的分析也可能揭示天然或意想不到的配体的存在，这些配体可能与蛋白质样品共纯化。Loo表示:“原生MS仍有很长的路要走，但随着更多治疗性蛋白质的研发，抗体药物的原生MS应用越来越广泛。”他进一步说:“仪器仪表仍然需要改进，整体灵敏度需要提高，采样吞吐量需要提高。”Loo的话得到了Heck的回应，他补充说:“数据分析是核心，生物信息学也必须改进，以跟上制药应用的步伐。”这些因素无疑将是确保本土MS在未来生物制药生产管道中拥有永久和核心地位的关键。

本土MS的前景是惊人的:有远大的梦想!

原生MS与目前在结构生物学中使用的几乎所有工具都具有高度的互补性。从相对少量的起始材料，这种技术可以迅速为结构生物学家提供基本信息。此外，将原生质谱与其他来源生成的数据(例如交联质谱、氢-氘交换质谱、表面标记和最近的低温电镜)巧妙地集成，提供了大量信息，从而生成真正模拟的结构在活的有机体内的情况。

赫克对未来的预测是:“样品制备将会减少，分析蛋白质结构将成为可能原位-直接从细胞到ms。”此外，他认为:“你可以做到多大是没有限制的，”例如，大规模细胞术是一种已经在整个细胞上使用ESI的方法。相反，他说问题应该是:“我们能得到什么样有用的生物学信息?”精确到什么程度?”

关于科学界，Loo说:“我很乐观地认为，本土MS的增长只取决于该领域每个人的创造性想象力。”尽管仍处于今天的科幻小说的领域，他建议:“当与自上而下的质谱等方法相结合时，原生质谱可以成为确定高分辨率蛋白质结构的工具。”他接着说:“自ESI-MS首次分析蛋白质复合物以来，已经过去了27年多;看看从那时起蛋白质MS所取得的进展。一个人仍然可以(也应该)有远大的梦想。”

参考文献

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