表型筛选-技术和技术的进展

表型筛选在药物发现中获得了新的动力，希望这种方法将提高药物批准的成功率。¹在本文中，我们将介绍一些最新的筛查工具及其应用。

什么是表型筛选?

表型筛选从本质上讲，科学家可以更好地模拟他们正在研究的病理，这广泛地意味着使用基于细胞的分析。但是，虽然细胞可能比使用纯化蛋白质的靶向分析提供更多的背景，但传统的基于细胞的分析使用在人工环境中生长的永生细胞系，而这些具有广泛的局限性。²

随着时间的推移，细胞的变化，培养条件和缺乏与之相互作用的相邻细胞或底物都是这些传统表型分析的局限性。²越来越多的研究人员正在探索诸如患者来源的细胞或组织、诱导多能干细胞、高分辨率成像和CRISPR等基因编辑技术等工具，以重新创建更好地反映人类疾病复杂性的分析。²

例如，在牛津大学的目标发现研究所，首席研究员Daniel Ebner领导了高通量筛选设施，他们与牛津大学、英国和国际上的团队合作，开发更多的预测性分析来提高目标识别。Ebner说:“我们与许多生物学领域和疾病病理学领域的广泛研究科学家合作，他们是各自领域的世界专家。”“所以，如果我们认为一个生理过程在特定的病理中非常重要，例如，伤口愈合中的治疗性血管生成，我们就非常适合开发一种筛选来识别促进组织修复的调节剂作为治疗靶点。”

他们最近与Ayman Zen博士的研究证明了这一点，该团队使用内皮管形成分析开发了一种高含量成像屏幕，并将其小型化为384孔板格式。用1280个生物活性小分子的注释化学库进行筛选，确定了一种类视黄酮激动剂他扎罗tene增强在体外血管生成和伤口愈合在活的有机体内．这种高含量的筛选发现了一种已经被fda批准的小分子，有可能被用于再生医学。^3.

免疫肿瘤学:通过先进的高通量流式细胞术推动发现的前沿

免疫肿瘤学包含了许多方法，但它们都有一个共同点:利用人体自身的免疫系统来对抗癌症。

下载本文了解先进的流式细胞仪如何克服这些挑战，推动免疫肿瘤学领域的创新。

观点的文章

赞助内容

表型筛选工具

Ebner的团队的主要重点是使用泛遗传工具(以前是RNAi，现在是CRISPR)，以及已知主要目标的小化合物。这是一个重要的区别，因为如果表型发生变化，它使他们能够非常快速地识别目标。“在科学领域，每天都有取舍。这里的权衡是，可能有大约3000或4000种蛋白质被服用过药物，或者有适度特异性地针对它们的探针，”Ebner说。“这意味着你只使用小化合物击中或询问了整个基因组的五分之一。或者，我们可以使用CRISPR和RNAi作为泛基因组工具，试图更好地识别治疗上重要的靶点，然而这两者本质上都消除了靶蛋白，这是一种不同于经典药物的机制。在这两种情况下，关键是利用科学家的专业知识，他们一直致力于研究特定的病理学或理解特定的细胞途径。”

Ebner目前正在与最近的诺贝尔奖得主Peter Ratcliffe以及爱丁堡大学和麻省理工学院的科学家合作，建立胶质母细胞瘤缺氧模型。“缺氧是一些胶质母细胞瘤的一个问题，因为它可以保护细胞免受放射治疗。我们的目标是利用彼得的专业知识来帮助我们建立一个模拟真实肿瘤缺氧的实验。然后，如果我们能识别出改变缺氧状态的小化合物，我们就能使胶质瘤细胞更容易受到放疗或替莫唑胺或其他治疗组合的影响。”

该实验室的主要读数是高含量成像，使用荧光显微镜可以拍摄数千张照片。这种方法利用不同的标签和自动化图像分析的软件。图像分析是由生物学家设置的，但它适用于整个屏幕。Ebner说:“它的吞吐量比基于平板的读出要低，但你可以从图像中获得更多的信息。”“高含量成像越来越多地转向使用人工智能和深度学习，你试图提取比你正在观察的主要表型更多的信息。”

CRISPR筛选技术的发展

在伦敦癌症研究所(Institute for Cancer Research)，史蒂夫·派蒂特(Steve Pettitt)博士致力于开发利用CRISPR探测药物敏感性和耐药性的方法。他说，现在还有其他新兴的CRISPR应用正在被用于屏幕。“很明显，CRISPR确实在改变功能性筛选。在CRISPR出现之前，我们有RNA干扰(siRNA或shRNA筛选)，尽管人们知道存在脱靶效应等问题，通常会以不可预测的方式影响其他基因，但他们开发了算法来解释这些问题，至少在某些情况下，这项技术运行得很好。但现在CRISPR已经出现了，它的易用性和缺乏这些缺点，导致更广泛地采用屏幕。”

事实上，最近一项使用CRISPR-Cas9诱变的研究表明，目前正在临床开发的许多癌症药物靶向的蛋白质对肿瘤生长不是必需的，尽管之前使用RNAi和小分子抑制剂的研究证明了相反的证据。⁴此外，当CRISPR被用于敲除其假设的目标时，测试的药物的功效没有受到影响——这表明许多药物是通过脱靶效应来激发其抗癌活性的。

Pettitt说，CRISPR的另一个好处是它非常灵活。这意味着您可以扩展细胞系模型的范围，例如，您可以进行筛选。他解释说:“RNAi是一项如此受欢迎的技术，而现在CRISPR也是如此，关键原因是你基本上可以通过合成一小段RNA来敲除一个基因。”“CRISPR指南非常容易合成，你可以在一个非常高的通量设置下完成，你可以设计定制的文库来敲除基因组中的每个基因或一组特定的基因。只要你能让CRISPR机器进入你的细胞，它就能非常可靠地工作。”

经典的CRISPR (CRISPR-Cas9)系统包括一个叫做Cas9的核酸酶，你可以用一个短RNA(20个核苷酸)来编程。RNA会引导核酸酶到基因组中某个匹配的位点核酸酶会在那个位点切割基因组。修复双链断裂会导致小的插入和缺失，从而导致基因的敲除。但现在，这项技术有了更先进的应用。

佩蒂特说:“我认为CRISPR有可能在某种程度上比RNAi更有创造性。”“有了RNAi，你真的只能关闭基因，但有了CRISPR——以及制造随机突变来敲除基因——如果你提供一个带有突变的模板区域，你也可以精确地编辑基因。这可以被整合到CRISPR的目标位点，这样你就可以引入你感兴趣的特定突变。”

一个这样的例子就是问题乳腺癌易感基因1突变:重要的是能够从功能上分类这些突变是良性的还是致病的。最近的一项研究使用CRISPR测试了编码关键功能域的外显子中所有可能的单核苷酸变体(SNVs)的96.5%乳腺癌易感基因1发现了超过400个非功能性错义snv，以及大约300个破坏表达的snv。这一知识将立即有助于临床解释乳腺癌易感基因1基因测试结果。⁵在另一项研究中，⁶Pettitt和同事们使用全基因组CRISPR-Cas9诱变筛查来识别引起PARP的突变形式在体外而且在活的有机体内PARP抑制剂耐药，并发现这些突变也可在具有致病性的细胞中耐受乳腺癌易感基因1与其他类型的PARP抑制剂耐药性相比，突变导致对化疗药物的敏感性不同。

佩蒂特说:“你不能使用RNAi进行那种程度的细节筛选，你可以设计定制的CRISPR，针对同一基因的许多不同区域，你可以找出蛋白质的哪些区域对你感兴趣的表型很重要。”

目前，CRISPR的其他进化正在被开发成屏幕。“例如，如果你突变Cas9的核酸酶活性，它仍然保留其定位到目标位点的能力，所以你可以将Cas9与转录激活剂或抑制剂融合，并使用CRISPR筛选转录抑制，以及敲除筛选，”Pettitt说。“还有一系列的CRISPR工具正在开发中，它们将通过引起错义突变而不是插入或删除，或引起DNA甲基化，或引入荧光蛋白来编辑碱基，这样你就可以看到细胞中DNA序列的位置。这是一个衡量CRISPR与RNAi相比有多灵活和有用的标准。”

那么，CRISPR会成为未来每个人都求助于表型筛选的技术吗?埃伯纳说:“我坚信，没有一种技术能回答所有问题。“CRISPR是惊人的，它的治疗或生物用途是科幻小说的东西。但作为识别目标的工具，它有一个重要的警告。CRISPR基因敲除就意味着这一点——它会去除原本可能存在于混合物中的潜在蛋白质。这与一种抑制蛋白质的小化合物非常不同，这种化合物仍然能够形成复合物，或者只是没有活性。这是一项具有变革性的杰出技术的完美例子，但它并不完美。没有什么技术是完美的。”

参考文献

1.郑伟，索恩，麦丘。表型筛选是药物发现的新方法。药物。今天2013;18: 1067 - 1073。

2.霍瓦特P，奥尔纳N，比克尔M，et al。筛选无关的基于细胞的疾病模型。新药发现，2016年11月;15(11):751-769。doi: 10.1038 / nrd.2016.175。Epub 2016 9月12日。

3.Al Haj Zen A, Nawrot DA, Howarth A，et al。类视黄酮激动剂他扎罗酮促进血管生成和伤口愈合。Mol Ther 2016 10月;24(10):1745-1759。doi: 10.1038 / mt.2016.153。

4.林et al。脱靶毒性是正在进行临床试验的抗癌药物的一种常见作用机制。科学翻译医学2019;11:(509)。doi: 10.1126 / scitranslmed.aaw8412

5.Findlay总经理，Daza RM, Martin Bet al。利用饱和基因组编辑技术对BRCA1变异进行精确分类。《自然》2018年10月;562(7726): 217 - 222。doi: 10.1038 / s41586 - 018 - 0461 - z

6. 佩蒂特是et al。全基因组和高密度CRISPRCas9筛查识别PARP1中的点突变导致PARP抑制剂耐药。Nat Commun. 2018年5月10日;9(1):1849。doi: 10.1038 / s41467 - 018 - 03917 - 2。