RNAi筛查的趋势
介绍
rna介导的干扰(RNAi)标准工具sequence-specific基因击倒通常与表型的改变,会导致识别未知的生物通路的组成部分。RNAi已经存在了大约十年,使高通量功能丧失对人类基因组屏幕。未来的研究需要做出一些决定之前RNAi筛查。这些包括决定是否单独筛选目标(所谓的“排列”方法)或汇集RNAi屏幕;选择是否屏幕基因组广泛关注已经带注释的基因家族的子集(例如特定目标类);并确定最佳的实验系统和类型的屏幕来回答这个生物感兴趣的问题。的一些技术因素包括RNAi交付和端点检测的方法检测所需的强劲表型,可靠和高通量的格式。的RNAi过滤网也需要定期了解最近的事态发展在集群空间回文重复(CRISPR)技术,有情况CRISPR方法比RNAi基因组编辑可能更合适。
HTStec 2014年10月进行了一次市场调查在RNA干扰(RNAi)筛查和基因沉默主要在学术界研究实验室、制药和生物技术。会议的主要目标是全面文档当前实践和偏好RNAi筛查,并理解未来的用户需求。本文包含从HTStec市场选择的结果的报告“RNA干扰筛选2014年趋势”。它的目的是为读者提供一个简短的了解最近的市场趋势。它涵盖了只有10的30原始问题详细完整的报告。充分发表的报告应该咨询查看整个数据集的细节的回答每个问题时,其分割和对未来的估计。请点击这里为更多的信息。
疾病领域RNAi筛查的目标:
关键疾病或研究领域最针对性的RNAi筛选化验了如图1所示。这表明,肿瘤/癌症领域最有针对性的目标(63%)。其次是免疫学/炎性疾病/自体免疫目标(33%);针对传染病(31%);然后神经病学/ CNS /神经退化/疼痛和代谢疾病/糖尿病目标(24%)。
图1 关键疾病或研究领域有针对性的RNAi筛选化验
分析偏好进行RNAi屏幕时:
的主要应用领域RNAi筛选化验报告如图2所示。这表明,新的治疗靶点的识别是RNAi的主应用程序筛选应用(57%)。其次是公正的屏幕识别基因调节各种细胞生物学过程应用(47%);屏幕识别小说的部分信号通路/级联应用(45%);然后屏幕识别基因调节癌症(41%应用)。兴趣是最小的RNAi治疗技术开发应用(只有20%)。
图2 主要应用领域为RNAi库筛选
使用的两种主要方法RNAi筛查在图3中给出。即:1)排列,每个独特的RNAi试剂或独特的试剂针对单个基因,比如一个小池的独立siRNAs瞄准一个基因,占据一个独特的微量滴定板,如一个384孔板;和2)集中的所有gene-specific试剂汇集在一起,集体或合成,并补充说,在随机的,细胞。这表明受访者主要使用一种排列方法倾向于(46%),或者他们使用排列和汇集方法倾向于(42%),只有13%的人喜欢主要集中的方法。
图3 首选RNAi筛查方法
今天RNAi屏幕调查的主要类型(2014)提出了如图4所示。这显示最调查功能屏幕——基于减少损失或损失的表现型(65%使用)。这是紧随其后的是损失函数的屏幕——基于增强的表现型(54%);然后合成致命的屏幕——基于双最低的或平行的淘汰赛细胞株合成一种杀伤力(28%使用)。CRISPR可逆击倒的使用是目前仅限于少数受访者(7%使用)。
图4 今天主要类型的RNAi屏幕调查(2014)
主要的端点(读数)监测报告进行RNAi筛查时在图5中。这表明板读者基于监测整个细胞反应(如可行性、细胞增殖)或高含量的显微成像/细胞表型标记参数最常用的端点(62%使用)。其次是量化信使rna的存在(40%);板读者基于细胞成像结合批量监控整个细胞的反应(21%);然后含量高的激光扫描血细胞计数表型标记/细胞参数(19%使用)。
图5 主要终端监控当事业RNAi筛选
转染方法用于核库筛选:
今天交付(转染)方法使用最多(2014)为核库筛选排名在图6。这表明,标准化学(lipid-mediated)转染列为最常用。其次是反向转染然后lipid-free转染。今天至少使用电穿孔和病毒转染。
图6 今天交付(转染)方法最常用的核库筛选
RNAi库筛选:
供应商编制RNAi库最感兴趣的受访者报告在图7中。这表明,那些RNAi库覆盖人类基因组是最感兴趣的(33%喜欢)。其次是目标类特定库如激酶,蛋白酶,GPCR、离子通道等。(28%的人倾向于)然后通路分析特定的偏好(20%)。
图7 受访者最感兴趣的供应商编制RNAi库
最大的挑战在RNAi筛选:
大多数限制调查应答者的RNAi筛查工作今天是排名在图8所示。这表明脱靶效应则排在了名单的最大限制。这是紧随其后的是水平的降低;可拆卸的不会产生一个健壮的表型变化;然后文章版面分析方法/反褶积。排名至少限制是不适当的控制策略。
图8 大多数被限制的RNAi筛查工作今天
供应商意识提供RNAi筛查试剂:
RNAi筛查试剂和耗材的供应商/供应商第一次走进心灵的受访者提出了如图9所示。这表明,热科学和生活技术是最公认的RNAi筛查试剂和耗材供应商(38%的人选择)。其次是通用电气Dharmacon(26%的人选择);西格玛奥德里奇/ Proligo(13%的人选择);试剂盒(8%的人选择);选择然后EMD-Millipore (5%)。所有其他的总和than10%更少的选择。请注意这个不应该被视为一个真正的市场份额投影。它是基于RNAi筛查试剂和耗材的供应商,首先进入心灵的受访者,这可能不是一样的那些他们购买大部分耗材。
图9 供应商/供应商的RNAi筛查试剂和耗材,第一次出现在我的脑海里
首选基因沉默的方法:
发现CRISPR-Cas9细菌的免疫系统可以再利用轻松地创建删除,插入和替换在哺乳动物基因组中有可能彻底改变基因组领域工程及基因治疗领域。CRISPR干扰基因发生错误时的修复DNA把它介绍了目标基因。RNAi扰乱基因功能以非常不同的方式,它干扰基因的翻译通过诱导快速降解目标基因的转录。因此RNAi可能比CRISPR验证新药物靶点,因为小分子药物只减少一个基因的功能,RNAi一样,而不是完全敲出来,CRISPR。目前高兴趣使用CRISPR RNAi作为替代方法在基因沉默。有鉴于此受访者被要求,根据现有的知识,目前的方法,他们认为是最有利的对所需的属性的列表技术用于基因沉默。这些结果呈现在图10所示。这表明,RNAi方法被认为更有利,大多数受访者使用的方便性,广泛的适用性,短实验转变,和成本效益。相比之下CRISPR特异性方法只被认为是可取的;和良好结果的可解释性。
图10 基因沉默的方法(RNAi与CRISPR)被认为是最有利的关于理想的技术属性
这些发现不符合的一些优势CRISPR扑灭的试剂供应商和建议需要采取更多的澄清CRISPR与RNAi的优点。
结论:
上面的选择报告的结果显示,肿瘤/癌症的疾病或研究领域最针对性的RNAi筛选化验。RNAi筛查检测的主要应用领域是新治疗靶点的识别。今天大多数RNAi筛选执行涉及一种排列方法,每个独特的RNAi试剂或独特的试剂针对单个基因,为一个小池(如独立siRNAs瞄准一个基因)占据一个独特的微量滴定板中。RNAi屏幕今天调查的主要类型的损失函数屏幕基于表型的减少或损失或基于表型的增强。主要的端点(读数)监控进行RNAi筛查时要么是基于plate-reader监测整个细胞反应如可行性、细胞增殖或高含量的显微成像表型标记/细胞参数。交付(转染)方法最常用的今天为核库筛选标准化学(即lipid-mediated)转染。供应商编制RNAi库受访者最感兴趣的是那些覆盖整个人类基因组。
这些选择的结果也证实,最大的挑战之一的RNAi筛查今天是脱靶效应,即大多数siRNAs不仅目标互补的目标基因,还放松数量未知的非标靶基因。这些非目标效应sequence-specific和内在的核。尽管取得了一些进展减少非目标效应,大多数可用的RNAi试剂还没有提供满意的保护。一些新的siPOOLs siTOOls生物技术,在这方面可以提供承诺。
RNAi筛查试剂和耗材的供应商/供应商第一次走进心灵的受访者是热科学和生活技术,通用电气Dharmacon和西格玛奥德里奇/ Proligo。所有这三个供应商交付的最前沿最广泛的基因编辑技术,包括CRISPR-Cas9系统。
受访者目前认为RNAi方法对基因沉默技术易用性比CRISPR更有利;广泛的适用性;短实验转变;和具有成本效益的,而CRISPR干扰方法被认为是更可取的只对特异性;和良好结果的可解释性。最近的研究结果表明,RNAi和CRISPR-Cas9系统互补技术具有良好的重叠,他们可以用来验证彼此的结果。与技术,研究人员现在有了一个令人印象深刻的工具箱阐明基因功能和使更好地理解基因组的药物发现。
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