SPR实验的守则

这种类型的信息并不容易获得与其他技术,只有终点可以获得的信息。实时分析,能够自动也对研究人员的吸引力。

在其最基本的形式,使用这种技术的想法是——通过共价耦合(永久债券)或通过捕获(临时债券),附加一个目标分子的黄金传感器芯片表面与自组装单层derivatized之前(SAM)或进一步水凝胶。然后,流的另一半绑定(分析物)在表面。依赖于目标耦合,分子的分子量比参与,目标和被分析物结合位点的数量,和被分析物的浓度注射,你将看到一个特征(一对)协会绑定曲线如果有两个生物分子间相互作用。这个绑定曲线衰减(分离)一旦不再提供新的分析物传感器芯片。实时的交互是折射率的变化随着时间单位。

而仪器设置和分析可能并不总是简单的,有一些指针,可以跟着简化方法开发过程和获得最好的数据。

方法开发

做看看任何已发表文献中对你的化合物(或相关化合物),特别是利用SPR。这提供了一个很好的起点,如果你不确定你想尝试的条件。

做工作时使用你所拥有的知识获得与你的化合物用其他技术来帮助SPR的开发工作。特别是,知道稳定酸、碱或离子溶剂可用于确定适当的再生解决方案。同样,如果你有先验知识的平衡解离常数(K_D),它会给你一个想法的你可能想要注入浓度。

做开始标准缓冲的耦合过程。例如,磷酸盐缓冲盐水(PBS)或熟知的缓冲盐(HBS)有或没有添加渐变20。总是使用pH值约(7.4是典型),除非你知道你的样品不稳定pH值。

做包括添加剂需要看到目标和分析物之间的绑定。例如,二硫苏糖醇(DTT)、氯化镁、二氯化锰或其他添加剂的类型可能需要根据目标和分析物样品被分析。

做开始与胺联轴器的开发工作,除非你知道对于某些低pH值会变性/禁用你的目标或你有一个标签在你的目标,你想要使用几个传感器芯片。考虑约束力的口袋在哪里(如果已知)在确定如何几个目标。此外,如果可能的话,考虑切换它一半的绑定两个耦合的. .

做使用大容量水凝胶传感器芯片的分子量目标远远高于分析物(右旋糖酐是最受欢迎的,但也可以使用其他类型)。

不气馁,如果初始实验不按计划进行。

做有一个备份计划,例如,尝试捕捉实验如果直接耦合不工作。

得到最好的结果

做计划固定目标获得少量的曲率分析物注射。首次实验,目标大约50 - 100年,当时看的比率分析物的分子量/目标倍的目标固定化(假设1到1绑定)。你可以根据需要细化实验后。记住,曲率的协会注入需要的一部分,以便最大响应可以确定动力学计算。

做朗缪尔等温线图如果你在注射最高达到平衡。计算K_D价值平衡的情节就等于获得的价值从全球动力学符合您的数据。

做分析物溶解于运行缓冲消除大部分转变(折射率的变化无关的绑定)。如果您使用的是DMSO溶液组成一个集中的分析物,一定要考虑到,当样本稀释和匹配样本稀释剂尽可能接近运行缓冲。通常的DMSO含量运行缓冲用于小分子注射1 - 5% DMSO溶液。

做考虑使用温度是一个变量。虽然大部分的实验是在25摄氏度,使用更高或更低的温度也是一个选择。例如,降低温度可以增加目标在更高的温度的稳定性会更好地模仿人体的温度。不同温度还允许您研究热力学参数。

做使用弱再生解决方案,提供完整的再生(返回响应基线或更低)。从而使目标不太可能随时间改变。如果再生困难考虑捕获实验。

不一个实验运行一次,并报告结果。实验必须运行在多种天以确保它是可重复的。

做全球符合(符合一起注射)表明不随浓度变化的反应。

做复制或者每个样本一式三份注射浓度显示表面(目标)并不随时间衰减。

在关闭

或许最重要的是,不要被吓倒SPR。遵循开发协议和指南和适应他们满足您的需求,您可以减少开发时间,最大化的结果。

作者:玛丽·m·墨菲博士应用科学家,Reichert生命科学