CRISPR如何改变高通量筛选

CRISPR文库为高通量筛选提供了巨大的优势，包括前所未有的编辑效率、准确性和速度。本文介绍了CRISPR筛选的基本原理及其最令人兴奋的应用，包括破解细胞信号网络，发现像COVID-19这样的病毒如何感染我们的细胞，以及寻找新的药物靶点。

高通量DNA测序的出现为我们提供了比以往任何时候都多的关于构成生命的基因的信息。然而，如果没有对序列如何生成函数的补充理解，测序数据几乎没有用处。

基因型-表型研究涉及改变特定基因的表达并研究其对细胞或生物的影响，使我们能够了解特定基因的功能，并最终了解整个基因组。这种方法对遗传学的历史至关重要，为包括人类在内的一系列物种的发育和功能提供了重要的见解。

早期的基因型-表型筛选方法应用了位点定向突变、同源重组和反义RNA等技术来导致功能丧失或改变基因表达。但这些都受到了限制，包括复杂的协议和高错误率。

最近，RNA干扰(RNAi)取代了在全基因组范围内敲除基因的最佳方法，而短干扰RNA (siRNA)则成为大规模表型筛选的领先技术。然而，这仍然只能实现部分抑制基因活性，并伴有很高的脱靶率。

进入CRISPR筛选

CRISPR/Cas9的发展曾获诺贝尔奖基因编辑系统改变了这一切。CRISPR / Cas9筛选是高效和精确的，没有困扰RNAi屏幕的脱靶效应。CRISPR是完全可编程的，通过使用单一引导RNA (sgRNA)靶向特定的DNA序列。

CRISPR能够大规模精确定位基因组序列——无论是删除、添加还是改变DNA序列——很快就成为全基因组筛选的主要系统。

除了针对基因组中功能完全丧失的基因的CRISPR敲除文库外，关于这一主题还有另外两种变体:CRISPR-a(激活)和CRISPR-i(抑制)文库，可用于以可控的方式上调或下调目标基因的表达，而不改变潜在的蛋白质编码DNA序列。

用不同的sgrna库转染细胞可以在整个基因组的单个实验中改变数千个基因，这已经成为研究人员研究生物过程遗传基础的一种流行方法。

虽然可以根据具体情况创建自定义sgRNA库，但实际上这是一个耗时且昂贵的过程。出于这个原因，一些公司现在正在提供现成的CRISPR库，用于高通量筛选。

多导向RNA文库

典型的CRISPR筛选旨在通过在编码区域的特定位置切割基因来敲除基因，然后由细胞的非同源末端连接(NHEJ)系统进行不完美修复。这会导致一小部分DNA的丢失或增加，产生移码，阻止基因工作。

虽然这种技术通常有效，但所产生的变化有时对基因功能没有影响，给筛查增加了一层不可预测性和不确定性。Synthego这家总部位于加州的公司提供获得授权的CRISPR筛选库人基因组学，通过使用多导频来克服这一问题策略。

“为了在任何给定的基因中实现基因敲除，通常需要筛选多个引导rna，不仅要确定哪些是活跃的，而且还要确定哪些可以产生移码。这是一项耗时的工作，而且确实会阻碍生成高通量、阵列基因敲除文库的设计工作，”Synthego的科学主管Kevin Holden解释说。

Synthego的策略采用了三种单独的sgrna，它们一起工作以确保高切割活性。这种多导方法在外显子的开始处产生片段删除，一致地导致基因敲除，提供了新的可重复性和一致性水平。

霍尔顿说:“多向导方法可以节省研究人员大量的时间，因为它消除了使用单个sgrna敲除基因时的评估、猜测和担忧。”

CRISPR筛选的最新进展

高通量筛选领域正在快速发展，近年来有几项创新开始发挥作用。

目前，全基因组CRISPR筛选首先使用联合指南一次性敲除几个基因，需要对阳性命中进行多轮进一步筛选，以锁定目标基因。液体处理技术的进步带来了从池式CRISPR文库到阵列式文库的转变，其中微量滴定板的每个孔都包含一组sgrna，旨在敲除或调节单个基因，这将大大简化目标反褶积的任务。

另一个发展是表型选择筛选。这包括用慢病毒编码的CRISPR文库感染一大群细胞，然后对它们进行选择挑战，比如病毒感染或耐药性。然后，任何存活的细胞都可以通过高通量测序进行分析，以识别人群中存在的引导序列，并揭示相关基因。

还有一些举措是引入基于crispr的基因扰动新方法，3D类器官等新模型，以及与单细胞RNA测序等其他技术的集成。霍尔顿还预见了这些文库所针对的基因组区域的扩展。

“我认为我们很有可能会看到CRISPR筛选文库开始针对基因组的其他有趣区域，而不仅仅是编码区域，包括启动子或增强子区域文库，内含子文库等等。”

为未来的药物研发提供动力

快速部署的高通量CRISPR筛选方法正在改变药物开发管道。

在目标发现阶段，CRISPR文库可用于敲除细胞中单个基因的大型阵列，并识别表型变化。一种常见的应用是合成致死率分析，其目的是通过与癌细胞内的突变相互作用来确定杀死癌细胞的新药。

CRISPR筛查也可以应用于研究的早期阶段，包括了解疾病的机制。CRISPR筛选是我们理解信号的基础癌症细胞例如，有助于确定癌症发展的一些关键驱动因素。

CRISPR筛选的另一个主要应用是了解病毒如何感染宿主细胞。在COVID-19大流行期间，CRISPR筛查有助于识别SARS-CoV-2进入人体细胞所需的关键蛋白质并确定了几种可以开发成新型COVID-19治疗方法的蛋白质。

通过SARS CRISPR筛选在该网站上，研究人员可以浏览迄今为止SARS-CoV-2 CRISPR筛选的结果，查看其质量控制措施，甚至比较多个实验的结果——这是研究界团结起来利用CRISPR筛选的好处促进全球健康的一个有力例子。

随着大规模高通量CRISPR筛选工具的不断发展，这一强大技术的应用仅受到研究人员寻找下一代靶标和治疗方法的想象力的限制。

作者简介:

Eric Rhodes是人基因组学。