了解ITC如何用于指导蛋白质(RNA)/配体结晶，并解决复合物结晶的常见问题。
Eric Ennifar, Cyrielle Da Veiga, Dominique Burnouf, Joelle Mezher, Barbara Puffer-Enders和Philippe Dumas。通讯作者:e.ennifar@unistra.fr Architecture et Réactivité de l 'ARN, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/Université de Strasbourg。
复合物(蛋白质/蛋白质，蛋白质/核酸，蛋白质/配体，核酸/核酸，核酸/配体)的结晶，即使是在特征良好的生物系统上，通常也是冗长乏味的，要么费时，要么消耗样本。如果利用生物物理方法对配合物进行适当的初步表征，可以显著提高配合物结晶的成功率。动态光散射(DLS)是评估样品结晶性的关键(1)。同样，基于热氟的DSC优化策略已被开发用于促进蛋白质/配体结晶(2)。等温滴定量热法(ITC)是研究分子相互作用的“金标准”技术，我们在这里表明，它可以是一种有价值的技术，以改善配合物的结晶。ITC是一种真正的溶液内技术，可以在一次实验中直接提供两个分子之间的完整结合曲线:两个分子之间的结合亲和力(Ka)、焓变和熵变(ΔH和ΔS)和化学计量学(N)被非常准确地获得(3-5)。这是ITC相对于其他同类产品的一大优势生物物理分析方法是它不受大分子大小上限或下限的限制，没有缓冲液限制，最重要的是，对于结构研究，它不需要任何标记。此外，我们最近证明，现代ITC设备和新的处理方法也可以获得比通常认为的更多样化的系统的完整动力学描述，从简单的配体结合到复杂的RNA折叠(6)。
ITC的主要限制是实验所需的样本量相对较大。然而，这不应该成为涉及核磁共振或x射线晶体学研究的结构生物学家的瓶颈，因为样品要求与ITC分析非常相似。由于样品在ITC实验中没有被损坏，因此可以回收并浓缩用于后续的结晶学实验。最后，ITC还可以用于评估核酸或复合物中使用的蛋白质的正确折叠。我们将在这里介绍一些这样的itc引导结晶的例子。所有实验均在Microcal™iTC200 (Malvern Instruments Ltd)上进行。
HIV-1基因组RNA二聚化起始位点(DIS)是一个高度保守的序列，具有茎环结构。该环包含一个自我互补的序列，通过在两个DIS发夹之间形成环-环(吻环)复合物来促进病毒基因组的二聚化。DIS环-环复合物的晶体结构(7)显示出与细菌16s核糖体氨基酰基- trna位点(A位点)的意外相似性，后者是氨基糖苷类抗生素的靶点(8)。因此，研究表明，HIV-1 DIS RNA也可以结合氨基糖苷类，因此可以成为针对HIV-1基因组RNA的新药设计的一个有吸引力的靶点(9)。在这里，我们将展示ITC如何用于指导由氨基糖苷利维多霉素和HIV-1 DIS RNA亲吻环复合物制成的复合物的共结晶。
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DIS/利维多霉素相互作用提供了盐依赖结合的一个例子，经常在核酸中观察到。氨基糖苷类作为许多核酸配体，具有正电荷，在低盐浓度下主要是静电作用引起的非特异性相互作用。然而，由于静电筛选，盐浓度的过度增加可能会阻止配体结合。因此，人们可以在各种盐条件下进行初步的ITC实验，以减少非特异性结合，同时保持特异性相互作用。在低盐缓冲液(25 mM KCl, 2 mM MgCl2, 25 mM碳酸钠pH 7.0)中进行的实验显示了两个结合事件，不能用单个位点模型进行拟合(图2A)。用两个独立的结合位点模型拟合表明，第一个非常紧密的结合与1:1的化学测量值，正如预期的那样(每个茎环有1个配体，吻环复合物有2个配体)，第二个结合位点具有低微摩尔范围的亲和力，对应于非特异性相互作用。因此，这种非特异性结合可能会阻止在含有100 mM浓度的>复合物的结晶条件下形成同质RNA/配体复合物。然而，在高盐条件下(200 mM KCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Na cacodylate pH 7.0)，只能观察到特异性的紧密结合(图2B)。因此，这种导致同质RNA/配体复合物的实验条件应该是寻找结晶条件的首选条件。
错误折叠是RNA结构研究中的一个常见问题。在这里，获得了预期的化学计量，因此这些ITC实验也评估了RNA的正确折叠，此外，使用了正确的抗生素浓度。
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ITC的另一个有趣的角度是实时监测化学计量学，以便在达到所需的RNA/配体比(假定≥1.0)时停止实验。例如，在200 mM KCl的DIS RNA/Lividomycin滴定中，当RNA与配体饱和时(红色箭头)，实验可以在第12次注射时停止。这种方法应考虑在化学计量可以很容易估计的情况下，即当所得到的s型曲线的斜率相当陡峭(威斯曼系数c≥100)和当off-rate常数(koff)被认为是缓慢的。在这种情况下，这种方法可以防止样品中存在过量的配体，并以最佳的RNA/配体复合物比例进行结晶。
我们在以下例子中使用非优化盐浓度的DIS吻环RNA/Lividomycin相互作用(ITC缓冲液由150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM Cacodylate钠制成，pH 7.0.)。所使用的RNA序列是化学合成的23个核苷酸长的HIV-1亚型a DIS，在第三个位置上含有溴啶(7)，以便于使用多波长异常色散(MAD)方法测定晶体结构。在ITC缓冲液中制备120µM浓度的RNA样品(RNA链)，并放置在ITC细胞中。注射器在ITC缓冲液中注入2.4 mM利维多霉素。ITC分析在12°C下进行，以改善复合物的形成(因为相互作用是放热的)，并保护RNA免受可能的降解。
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在ITC实验之后，使用微中心回收ITC细胞中形成的复合物，并将其浓缩约三倍(在4°C下保存RNA/配体相互作用)至约400µM。然后，使用商用结晶稀疏矩阵筛(包含96种不同的结晶条件)和结晶机器人将该溶液(1/1体积)混合在结晶盘中。用稀基质溶液填充结晶储层，放置托盘在37°C孵育。适用于衍射(使用同步加速器x射线源高达1.6 Å分辨率)和结构测定(图4)的大单晶应该在使用Hampton Research®Natrix HT稀疏基质条件孵卵16-24小时后生长(图4)。
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核糖开关是信使RNA的未翻译区域，它结合特定的代谢物。结合后，观察到构象开关，从而调节参与核糖开关底物生物合成的蛋白质的表达(12)。大肠杆菌的ThiC TPP核糖开关对辅酶硫胺焦磷酸盐(TPP)有反应，这是维生素B1的一种活性形式(13)(图5，上)。在本例中，我们使用了与Ecoli TPP适体结构域相对应的85个核苷酸合成RNA片段(6)。这样一个具有复杂二级和三级结构的相当大的RNA的一个主要问题是在过度生产、纯化和体外复性过程后，如何恢复正确折叠的分子。
在第一步中，尝试以下重折叠方案(RNA第1批次):纯化后，RNA被热脱液，在冰上快速冷却，并放置在由pH 6.5 50mM的碳酸钠、100 mM的醋酸钾、5 mM的醋酸镁制成的ITC缓冲液中。RNA重折叠后，在25°C下进行ITC实验:将30 μ M的RNA放置在ITC细胞中，注射器中装载TPP 500 μ M。这个ITC实验表明，只有大约一半的RNA能够与TPP配体结合，这是RNA存在严重错误折叠问题的一个强有力的指标(图5，中间，见“Batch 1”)。然后，在ITC细胞中形成的RNA/TPP复合物被回收、浓缩并用于上述HIV-1 DIS吻环RNA的结晶试验。然而，从这些结晶实验中只观察到清晰的液滴(图5，左下)，这与RNA的主要部分错误折叠的假设是一致的。
在第二步中，RNA折叠方案被改变:在90°C在H中热变性3分钟后2O时，将核糖开关冷却至室温40分钟。将10X ITC缓冲液添加到最终1X浓度，并在室温下进一步孵育40分钟。对这第二批RNA (30 μ M RNA, 500 μ M TPP)进行的ITC实验表明，这种RNA重折叠协议导致完全活跃的核糖开关，因为100%的RNA能够结合TPP配体(图5，中间，见“批次2”)。经过结晶液滴的浓缩和建立，可以得到衍射分辨率高达5 Å的大单晶(图5，右下)。这清楚地确定了在建立结晶试验之前使用ITC作为复合物形成的质量控制的利益。
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在细菌中，DNA聚合酶加工因子，或β滑动钳，是一种同源二聚体，通过它们之间的相互作用，通过一个小的保守肽进入钳的疏水口袋，赋予DNA聚合酶和其他参与DNA代谢的因子高加工能力(14)。短合成肽已被开发出来，以干扰这种相互作用，防止滑动钳与DNA聚合酶结合，从而发挥抗生素的作用(15)。本研究的目的是将铜绿假单胞菌夹钳与合成肽结合共结晶，以获得这种相互作用的结构见解，并帮助基于结构的新型抗生素肽的基本原理设计具有更好的亲和力。在结晶之前，将β滑动钳(35µM在Hepes pH 7.4 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM中)置于ITC细胞中，将肽(300µM)置于注射器中(图6a)，进行ITC实验。该复合物进一步用于结晶试验后，浓度为47毫克/毫升使用微中心。通过将一体积的蛋白质/肽复合物与一体积由0.1 M钠Mes pH 6.0 100 mM, CaCl2 100 mM和20-30% (w/v)聚乙二醇(PEG) 400制成的储液混合来进行结晶。在20°C下孵卵数天后，使用同步辐射获得了衍射高达2.2 Å的大单晶(图6b)，并解决了x射线结构(图7)。
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ITC技术可应用于生物大分子配合物的结晶工作流程，可作为提高结晶成功率的指导:
结构研究的样品要求非常适合ITC分析
实际活性蛋白和/或配体浓度的评估(由观察到的化学计量学提供)
通过监测化学计量学实时确定优化的蛋白质/配体比例，用于复合物的结晶
有助于优化复合物的形成(样品的同质性，亲和性，特异性)
“免费”提供了相互作用的完整热力学剖面。只需要ITC分析后将样品浓缩即可。
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