本白皮书讨论DSC分析和例证的原则与基本应用程序。DSC的好处和细节进行了讨论。
DSC的主要优势是,它是基于热测量,因此允许本地生物分子的特性。此外,光谱数据的缺乏意味着样品不需要光学清晰。此外,描述不仅限于融化温度(T米),但是它还提供了数据部队参与生物分子的折叠和展开的机制。
在溶液中生物大分子的热力学孤立不容易解释的。测量值总是的净效应之间的相互作用组在相同的分子和交互组可以使溶剂。能量稳定生物系统因此许多有利的区别以及潜在的不利的交互。这一事实是一个启示,许多研究人员和DSC测量这一点很清楚。不会丢失,不过,和一个细致、有条不紊的可以开始解剖互动的复杂性。DSC还发现许多其他用途,部分基于能力的整体相关的热力学变化部队负责稳定高分子和没有任何光学组件。DSC可以测量简单效果如何与大分子质子化作用的变化影响到热力学和稳定性。这种方法可以扩展到包括任何共价结合配体,给出一个通用的筛查方法绑定。在有利的情况下,这种方法可用于确定绑定常量。这里讨论了热力学背景DSC测量在研究蛋白质的稳定性及其应用单独和与配体相互作用。 However, the techniques are equally transferable to other biological macromolecules such as nucleic acids, lipids, and so on.
当温度增加生理相关范围外,蛋白质进行结构化之间的过渡,原生生物活性构象(N)和非结构化,蛋白质变性和不活跃的构象(D)。分享这种行为与其他生物大分子(DNA,脂类等)和有机聚合物。如果信号的蛋白质构象转变之后,报告一个s形如下面可以看到痕迹。
 |
当蛋白质的结构融化在这种方式,没有改变共价分子的性质。只有摄动和共价相互作用,在许多情况下,当蛋白质冷却下来这些交互将自然而然地改革,产生活性天然构象。因此N和D是在可逆的平衡温度作为强度变量:
 |
在图1中N和D的比例变化,这个平衡驱动向D可以看到随着温度增加。在任何温度可以定义一个平衡位置,平衡常数(K情商),它仅仅反映了N和d的相对浓度在对数刻度平衡常数表达的吉布斯自由能(ΔG):
 |
 |
与气体常数R和T,开尔文温度。时的温度D和N的浓度相等的定义是过渡或熔化温度T的中点米。在这个温度下,K情商等于1和ΔG是0。T米是一个重要的参数对任何蛋白质,因为它表明其热稳定性。低于这个温度本机蛋白质的浓度高于变性,而T以上米,更多的蛋白质变性。
蛋白质显示这种熔化行为的原因是本国大量的交互结构稳定的温度依赖自己。稳定的焓(ΔH)需要交互涉及债券,构建,和内部能量减少,而稳定通过熵(ΔS)反映了无序化的互动和增加的数量方面,系统可以用相同的能量。熟悉这些术语ΔG相关的方程:
 |
结合方程3和4和重新安排给了范托夫方程5的平衡常数随温度的变化可以策划产生的热焓和熵在一个简单的线性关系(lnK变性情商vs1 / T):
 |
图1中的数据可用于确定K情商在过渡区温度。焓的决定以这种方式被称为范霍夫焓和依赖的形状DSC痕迹。因此不能直接测量的反应热。
不出意料,量热法,从拉丁文,液态气体,这意味着热,metrium直接测量,是一种确定蛋白质的变性焓。敏感的热量计,如MicroCal™VP-Capillary DSC,适合准确测量分数的焓变毫克的材料是可用的。这些仪器是使用简单、准确、可靠,使热量测量这种类型的常规生物物理实验室的一部分。该系统通过测量热容(Cp)蛋白样品溶液而扫描温度的上升或下降。Cp只是所需的能量提高样品温度一定,通常1 K,并与焓基尔霍夫定律:
 |
多余的(微分)蛋白质的热容是测量相对于精心匹配溶剂参比电池在扫描,因此这些类型的乐器被称为差示扫描热量计。
DSC测量图1相同,除了现在的财产蛋白质在变性后热容。构象转变,如在图2将观察到的。
 |
 |
从焓方程6很明显,获得多余的热容必须集成功能。可以做到这一点之前,仪器基线时观察到样本和参考细胞只包含溶剂必须被删除。因为技术原因,仪器基线不给零过剩细胞之间的热容(红色实线,图2上面板)。基线减法后,转变峰的线性区域两侧,代表当地的热容和蛋白质的变性状态,外推到过渡,然后将它们合并通过转型与发展。这是用软件例程。最后,导致峰下的面积是集成给DSC的多余的能量要求变性的蛋白质样品室。提供蛋白质溶液的浓度和量热计的操作量细胞是已知的,这个能量可以转化为ΔH热量或焦耳每摩尔的蛋白质。通常ΔH卡尔用于指示一个直接测量量热焓。
MicroCal VP-Capillary DSC是一个非常敏感的仪器能够测量非常小的变化,热容与稀溶液中蛋白质变性有关。热容的蛋白质的溶剂超过许多数量级。因此最准确和可靠的测量必须消除背景热容仔细通过确保蛋白质的溶剂成分是完全匹配的样本和参考解决方案。透析或色谱法是合适的方法,最后的透析液或列flowthrough用作参考的解决方案。
图2中的数据也可以分析在蛋白质的其他财产一样,经历了一个变化对变性正如上面所讨论的。这使T米和依赖于模式的范霍夫焓;现在ΔHvH从ΔH区分它卡尔。焓比较这两种测量,得到了同样的实验,提供了一个强大的蛋白质变性测试模型。ΔHvH给合作单位的能量每摩尔ΔH时的平衡卡尔蛋白质的能量每摩尔。如果这些能量都是相同的,那么蛋白质和合作单位是相同的,或者可以设想有相同的分子量,从而确认平衡的两个州的假设。
在选择场景中,ΔHvH小于ΔH卡尔,这表明平衡物种的平均分子量低于变性的蛋白质和方案涉及中间体(I)可能更合适:
 |
在极端情况下的变性过程中产生的中间体、独立当蛋白质折叠领域等不同的热稳定性,两个截然不同的转换可能会观察到。在这里,ΔHvH每个转换将在ΔH反映每个域的分子量卡尔基于整个蛋白质的分子量,将反映变性系统的总能量,这是两种转换下的总面积。
还可以有ΔH的情况vH大于ΔH卡尔表明分子量的大小或物种的平衡比的蛋白质。这是情况下,蛋白质形成二聚体,四聚体或高阶总量与ΔH的比率vH对ΔH卡尔反映,至少在原则上,协会的秩序(n):
 |
与方程7,这仍然是一个两国并存的均衡以来仅包含了N和D。ΔH的比率的差异vH对ΔH卡尔反映了这样一个事实:每摩尔浓度的计算是基于子单元,而寡聚蛋白质。
这也增加了重要的一点,ΔH的价值卡尔完全依赖于样品的浓度。任何错误的浓度会直接转移到估计的焓。这些包括错误的物理测量浓度,通常通过吸光度光谱、消光系数中的错误的蛋白质,以及引入的误差不到100%纯物质(蛋白质污染物导致吸光度,但有不同的T米值可能不是在DSC)或低于100%折原生材料(变性蛋白导致吸光度但已经展开)。因此一些必须注意解释ΔH比例的小差异vH对ΔH卡尔。
样品纯度和浓度的准确定量是最重要的元素在DSC实验设计和数据解释。
如果ΔH的比率vH对ΔH卡尔表明一个寡聚变性计划(Eq 8)很容易证实这一点通过检查浓度依赖的DSC测量。因为平衡浓度的变化说,单体的形式,然后单体的浓度,通过质量作用或勒夏特列原理,影响到平衡位置。因此,热稳定性低聚物的系统预计将增加与增加浓度被认为在实践中(1、2)。
检查样品浓度依赖的DSC测量是一个关键的测试机制,总是值得做,如果样品可用性允许,即使ΔH的比例计算vH对ΔH卡尔接近1。
DSC测量完成后,一个简单的和潜在的实验又重新扫描相同的样本。如果一个相同的恒温动物观察到在重新扫描,可以得出的结论是,本地的交互完全可重复和变性状态处于平衡状态。在大量的情况下,然而,没有过渡或减少级重新扫描的蛋白质之一。这表明有一个不可逆转的步骤变性的机制:
 |
在这个单分子(U)计划过程,如脱酰氨基作用,脯氨酸异构化等可导致不可逆的修改,防止重折叠。通常,重复性可以提高通过扫描温度略高于过渡区,而不是DSC将达到最高温度,因为有一个动力元素(率)不可逆转的步骤。这个速度很可能更快更高的温度。因此,温度越高访问和变性的时间越长,收益越不可逆转的步骤。
不可逆转的步骤也可能源于协会或聚合(Ag)的变性状态:
 |
这将体现在浓度依赖性最初的扫描参数。在更高的样品浓度D的浓度会增加,这样不可逆转的步骤加快,导致较低的T米的蛋白质。在重大和快速聚合的情况下甚至可能扭曲和截断变性过渡与放热聚合事件,观察非典型的噪声数据高于过渡区,如下面。
 |
量热法不是一个宽容的技术在这方面经常DSC,旗帜聚合问题不明显在spectroscopic-based热变性实验做类似的样品浓度。在这两种情况下的不可逆性,它是信息检查样品浓度和扫描速率依赖的DSC测量。事实上,在某些情况下,这些信息可以用来提取有意义的参数从最初的平衡事件甚至逆转率的估算值(3、4)。
检查在DSC扫描速率依赖的测量是一个关键的测试机制,总是值得去做如果样品可用性允许,即使在平衡系统是高度可重复的和。即使在最简单的单分子的平衡(Eq - 1)必须证实,N和D的平衡浓度反映系统在这些条件下的稳定性。这些浓度变化速率等于正向(展开)和反向的总和(折叠)反应的平衡。因此如果温度上升速度比系统可以改变,位置和形状的DSC电热会扭曲。这将导致错误的T米值和异常ΔHvH对ΔH卡尔比率。作为一个经验法则,60 K / h是一个好的起点对于大多数蛋白质。
这个比较使用的焓变,焓本身的技术提供了一个准确的测定和T米价值。正如已经指出的那样,T米反映蛋白质的热稳定性。这个不应该直接等同于稳定的寿命样本的活动或其货架寿命因为这可以有额外的动力维度引入的一个不可逆转的步骤。在最简单的平衡(Eq - 1)与完美的可逆性,蛋白质,理论上,无限搁置寿命。显然,在温度高于T米活性天然态人口较少,活动水平的相应减少。T以下米本机结构系统可能会重新活跃。在最简单的情况下的不可逆变性(Eq 9),在温度高于T米非平衡步骤的速率,与折叠的竞争从D N,将决定蛋白质会保留多久填充的机会积极的原生状态。甚至远低于T米,平衡常数意味着大多数蛋白质的原生状态,D U是不可逆转的事实意味着一旦转化为U的分子不再平衡。保持适当的[D] / [N]比率,是由K情商,蛋白质会变性。再一次,这是动能率决定多久本机,蛋白质将保持活跃。说,这显然是明智的存储蛋白质远低于其T米和常识表明,T米和货架寿命相关的。所有的反应将放缓在较低温度包括D U的一步。此外,如果,因为通常情况下,不可逆转的步骤涉及到两个或两个以上的变性蛋白的聚合(Eq 10),然后D的浓度越低,反应速度会慢。
也是误导热稳定性等同于蛋白质的均衡稳定温度远从T米。外推的平衡常数,因此ΔG,远离T米很复杂,取决于许多参数,考虑如下。这个推断是明显的非线性,因此蛋白质高的T米不一定会有一个更大的在较低的温度低于其他蛋白质TΔG吗米值。
确定的焓变DSC实验适用于T米的测量,因为这是他们的决心的中点。在这个温度ΔG是0,从方程4,ΔS =ΔH / T米。换句话说ΔS得到消除,但不是通过测量,和所有的错误在确定ΔH和T米将传播到ΔS。
就好了,认为这些基本热力学量会给人一种深刻的洞察力量稳定蛋白质结构。毕竟,蛋白质是很像生物乐高™。的玩具,只有少数类型的砖和他们只加入几方面,但结构和功能的多样性,可以建立在这些限制是巨大的。在生物学中只有数量有限的化学组(砖)的蛋白质多肽可以互动;组织骨干羧基、酰胺和氨基酸侧链。这些团体使用一组同样小的互动一起加入自己:范德华力、氢键、静电charge-charge景点和疏水性的影响。这样的互动,通过共价性质,在两个极端之间的平衡,系统相互作用和不相互影响的,因此可以由上述热力学描述。因此ΔH和ΔS决定蛋白质的变性必须告诉一些关于这些相互作用的性质和强度。
遗憾的是,这些都是信息丰富。平均蛋白含量会有成百上千的交互,这些将对整个分子求和,以确定其热力学。不可能孤立地打扰一个交互。通常,显示了一个高水平的蛋白质的协同结构,所有的相互作用和蛋白质是本地人,或所有的相互作用,蛋白质变性。
此外,每一个化学组蛋白还可以与水分子间相互作用和溶解的盐,以及分子内。每个相互作用的热力学将反映净差异群体聚在一起,当他们分别由水分子溶剂化,使情况更加复杂。
尽管无法解释的价值观ΔHΔS隔离,仍有大量可以用这些参数。他们下定决心在T米ΔG哪里0如果我们知道他们的温度依赖性那么ΔG可以在所有其他计算温度。要做到这一点,热容的变化(ΔCp)必须已知蛋白质的变性。DSC热容措施以来,变化对变性可能是潜在的决定直接从这些数据(图2)。实际上,进度基准函数前必须应用集成的峰面积,因为这个非常不同。
ΔCp如图2所示,蛋白质是大的和积极的。它的价值可以从每个DSC实验,但它也可以一样准确地确定仅从蛋白质的大小(5),蛋白质大ΔC越大p,反映出其价值相关的事实很好总非极性表面时埋在蛋白质折叠的原生状态。
ΔHΔS与温度的变化是基尔霍夫关系另一种表达方式:
 |
导致温度依赖性ΔG计算根据:
 |
确定ΔC方程11还提供了另一种方法p。如果ΔH蛋白质测量在不同条件下的稳定性,然后ΔH的变化,δΔH /δT,会给ΔCp。如果这些实验使用适当的缓冲如下面所讨论的,这可能是最准确的估计ΔCp因为它基于ΔH独立测量。
方程12、ΔGΔH和ΔS可以计算在任何其他感兴趣的温度。这样估计会有错误反映出原始误差测量T米和ΔH以及温度外推离T的长度米。较长的推断温度复合错误可以成为重要和估计的大小应该引用。比较ΔG,ΔHΔS系统之间或不同溶剂条件下,必须推断一个常见的温度的测量数据的比较。
是很没有意义的比较两种蛋白质变性的实验确定ΔH因为这些测量在各自的T米值。这样一个比较需要ΔH数据的外推共同使用ΔC温度p每个蛋白质。这个温度是T最好是两者之间的中间点米值(T1米+ T2米)/ 2外推误差降到最低。
在定性层面上这种类型的比较可以,可能标记了一些总系统的变化。正如已经指出的那样,变性过程的复杂性使得任何详细解释的数据,或改变其值,非常困难。然而,有些实验策略,最终可能开始阐明特定的相互作用来稳定蛋白质结构的贡献。定点诱变改变特定蛋白质侧链,可以用于一个非常微妙的方式,比如通过删除一个甲基一半埋在蛋白质的核心。
如果这些突变的热力学与高分辨率结构信息可以增强父母蛋白质和突变,有此变化的机会。这种方法可以扩展到突变的两倍或三倍周期确认能量或交互的有效性包括溶剂的变化(H20vsD20)来探测氢键(6)。
到目前为止我们已经看到热力学数据的复杂性和信息内容是有问题的。然而,有出DSC方法来利用这一宝贵的用途。例如,蛋白质的氨基酸侧链protonatable组在pKa变性可能经历一个转变。在原生状态与之交互的其他指控团体在变性分子与溶剂相互作用。的pKa只是表示集团之间的平衡常数使质子化和unprotonated形式,如果这个平衡变化在变性过程中,质子将被释放或吸收的蛋白质。由于缓冲区中研究和行为保持pH值(质子浓度),质子参与蛋白质变性的平衡将提供的缓冲区,这一过程也将有一个关联的焓。这焓是不同的每个缓冲区根据其化学。如果ΔH量在不同的pH值缓冲区在同一蛋白质变性,将观察到不同的值,反映ΔH之和为蛋白质事件和ΔH缓冲电离。策划的观测值对ΔH电离的缓冲区将线性函数的斜率(正面或负面)反映了质子的数量(和所有pKa转变)与蛋白质的变性有关。
 |
的选择缓冲设计DSC实验时是很重要的。对于日常工作,一个缓冲区小或零电离焓比因为这可以消除任何测量电离的贡献。缓冲区如甲酸、醋酸、磷酸是不错的选择,因为他们可以忽略不计的电离,可在高纯度,便宜。这些缓冲区也有优势,他们的pH值和温度变化保持不变;显然DSC测量的一个重要因素。这也是他们的小热的电离的结果。
另一个后果的蛋白质在本机protonatable组pKa的不同和变性状态是其K情商,因此ΔG将质子浓度依赖的解决方案,是博士在此之前的质量作用定律或勒夏特列原理。如果变性K情商影响溶液的pH值通过释放或吸收质子则认为,溶液的pH值会影响K情商的蛋白质。这种效应可以量化:
 |
Δυ质子化作用的变化。质子化作用在dentauration变化越大,越大的变化稳定pH值为每个单元。的作用只是体现的是一个潜在的质子化作用的不同状态之间的pKa集团解决方案,暴露在变性状态,和群体的pKa原生状态,它可能与电荷相反组交互,降低酸度系数或与like-charged组织提高pKa行动。典型的pKa蛋白质是两单位的变化。蛋白质通常有一个钟形稳定pH概要,这反映了这种效果。酸性组织蛋白质的pKa大约是4和基本组10所以稳定的重大变化发生2和6和8到12之间。在中性pH值,唯一的pKa是组氨酸,这可能会或可能不会调节稳定在这一地区。
DSC可以用于确定蛋白质的热稳定性在几乎任何感兴趣的pH值。T米和可以用来计算ΔGΔH比较常见的温度和pH值稳定概要文件可以使用方程分析了13在任何博士获得变性的质子化作用变化的影响具体带电残基的突变蛋白在这些概要文件可以表明哪些组参与质子化作用的行为。
它可以方便简单认为蛋白质非共价连接配体,有不同的“亲和力”(pKa)本机和变性状态。记住这个类比,我们可以立即看到质量作用的影响必须适用于任何配体,对本机有不同的亲和力和变性状态。大多数(如果不是全部生物相关配体紧密结合,特别是原生状态的同源蛋白质和不使用相应的变性。因此,当他们变性影响配体释放到溶液的浓度。质量作用的效果是,当溶液中的配体的浓度改变将影响本机变性平衡,这是蛋白质的稳定性。
这种方法可以用在两个方面,首先是一个粗糙的配体结合蛋白的筛选工具。蛋白质的热稳定性是衡量自己的然后在配体的存在筛选成为可能。这些被添加在某种程度上过度集中的蛋白质,以确保合理的配体结合亲和力将饱和蛋白质结合位点。在这种情况下,热稳定性增加,有证据表明,在蛋白质的变性有稳定的温度通过绑定到本地状态。反之,减少热稳定性表明配体结合变性而不是原生状态。一些警告如果热稳定性的变化,必须附上小自配体也可能间接采取行动改变离子强度或pH值,它可以调节的稳定性。合适的控制可以解决这些可能性。
第二个,更定量使用这种方法包括测量热稳定性增加配体浓度的函数。如图5所示的结果,这样的数据可以用来获得估计配体和蛋白质之间的结合常数(7)。
 |
这种方法有几个优点超过其他更传统的方法。方法可用于确定非常紧密的绑定常量,不能以传统平衡方法。信号测量ΔH,蛋白质变性的一个普遍特征,所以没有需要开发特定的方法为每一个蛋白质的研究。此外,高浓度的配体,可以有问题可以使用在光谱的方法。混合配体可用于屏幕竞争绑定到一个已知的配体,或复杂的组合筛选协议。
最近的DSC仪表和自动化技术的发展允许生产自动化高通量DSC、MicroCal VP-Capillary DSC(8),以及使用自动机器人示例加载,这些仪器扫描速度更快的速度使整个测量更快速。之前使用更高的扫描率是明智的依赖T米和焓变参数,以确保系统在平衡正如上面所讨论的。一旦建立了系统可以获得多达25扫描或在24小时内,可以装载样品,在冷藏舱,将使仪器运行一周。
这个自动化的DSC方法是一种强大的分析工具描述蛋白质和其他生物分子的稳定性。解决方案条件(pH、离子强度、添加剂)影响蛋白质的热稳定性可以快速评估。这些信息可能是使用为货架寿命研究或结晶试验表明最优条件。同样,配体结合蛋白,从而提高其热稳定性,可以为特征,详细评估鉴定后在一个更高的吞吐量主屏幕。
本白皮书是由克里斯·m·Johnsson博士目前在医学研究委员会蛋白质工程中心,山的路,CB2 2本书,英国剑桥。电子邮件;cmj@mrc-lmb.cam.ac.uk
啃老、动向和蒂姆,D.E.二聚的蛋白质的构象稳定性:定量研究平衡变性。普罗特。Sci。2167 - 2174 (1994)。
约翰逊,C.R.等。四聚物的结构稳定性的热力学分析p53肿瘤抑制基因的寡聚化域。生物化学34岁,5309 - 5316 (1995)。
Freire, E。等。Calorimetrically确定动态复杂的演变在蛋白质的转换。安。启Biophys。化学。19日,159 - 188 (1990)。
Lepock,黄。等。过渡率和扫描速率对动力学的影响模拟的差示扫描量热法的可逆和不可逆的蛋白质变性。生物化学31日12706 - 12712 (1992)。
迈尔斯,J.K.等。变性剂m值和热容变化:与易触及表面蛋白质领域展开的变化。普罗特。Sci。2138 - 2148 (1995)
康奈利,公关等。焓的氢键形成蛋白质配体结合的反应。Proc。国家的。学会科学。美国、91、1964 - 1968 (1994)。
照相机、参考书籍和林L.N.强ultratight蛋白质相互作用的研究使用差示扫描量热法。生物化学29日,6927 - 6940 (1990)。
Plotnikov,教授等。一个autosampling差示扫描量热计仪器为研究分子相互作用。试验药物开发。抛光工艺。83 - 90 (2002)。
库珀。等。微分扫描microcalorimetr,Protein-Ligand交互:流体动力学和量热法(哈丁,大肠和Chowdhry b z eds),牛津大学出版社,287 - 318页(2000)。
Freire,大肠差示扫描量热法。摩尔。生物方法。191 - 218 (1995)。
Privalov, P.L. Potekhin, S.A.扫描微量热法研究温度引起蛋白质的变化。方法Enzymol。131年,4-51 (1986)。
李子,ge和布雷斯劳,kj蛋白质和核酸的量热法。咕咕叫。当今。结构体。医学杂志。682 - 690 (1995)。
一堂课金丝等。差示扫描量热法:在药物开发中的应用。制药。科学。抛光工艺。今天311 - 320 (1999)。
Clausse D。等。形态学特征的乳剂差示扫描量热法。Sci放置胶体界面。117、59 - 74 (2005)。
鼻子,A.E.等。长期稳定性研究药品微量热法:应用程序。Int。j .制药。179年,159 - 165 (1999)。
H.R.等温滴定,Jelesarov, i和博斯哈德量热法和差示扫描量热法研究生物分子识别的能量补充工具。j·摩尔。Recognit。12日,3-18 (1999)。
Plotnikov,教授et al。一个新的超灵敏扫描热量计。肛交。物化学。250年,237 - 244 (1997)。
