聚合的生物和合成材料是一个严重关切的来源,提出问题发现和形成过程的不同阶段。脂质体用于药物发现和药物输送了一段时间,和生物物理特性这些系统和它们的有效载荷是理解其功能的关键。就是这样一个有效载荷膜相关受体酪氨酸激酶(RTK)目标继续发现许多活动的重点。rtk通常是单次的跨膜信号传导蛋白很难净化完好无损,在许多疾病的途径和重要目标。我们的目标是将数据与以前公布的活动变化大小和liposome-RTK复杂的以纳米颗粒的聚合状态跟踪分析(NTA) NanoSight产品范围从莫尔文仪器。
聚合的生物和合成材料是一个严重关切的来源,提出问题发现和形成过程的不同阶段。识别和描述聚合的能力是广泛的实用工具,和这里所描述的实验表明纳米粒子跟踪分析的独特能力(NTA)技术理解的动态聚合在一个生物系统通过高分辨率particle-by-particle分析。
工作提出了白皮书,模型系统是利用,用于药物发现研究和试剂特性提出了独特的挑战。这个系统允许生成功能组装的克隆/重组膜受体在脂质体,没有完整的受体的结合的必要性。目的是以前公布的活动数据相关联1、2与的大小变化和聚合状态liposome-RTK复杂的以纳米粒子跟踪分析(NTA)。预计这里描述的实验表示表征纳米领域的广泛实用的方法。确定大小,多分散性的评估和识别组件促进聚合都感兴趣的,都可以通过这些简单的实验评估。
脂质体用于药物发现和药物输送了一段时间,和生物物理特性这些系统和它们的有效载荷是理解其功能的关键。这样一个负载,我们调查了在这里,是膜相关受体酪氨酸激酶(RTK)目标继续发现许多活动的重点。rtk通常是单次的跨膜信号传导蛋白很难净化完好无损,在许多疾病的途径和重要目标。选择这个模型描述系统因为存在的丰富的活动数据。
对于这个工作,我们首先研究了RTK的聚合状态代表目标(胰岛素受体激酶结构域)。然后分析了RTK工程细胞样的支架,特别是一种脂质体携带nickel-chelated头组(引用1和2)中描述。简单地说,镍头组促进template-directed自组装的His-tagged RTK,这样激酶域(细胞质碎片)是面向好像在细胞内(图1)。分析了使用镁(Mg)或锰(Mn)作为分析缓冲区可用的抗衡离子,为了理解为什么锰可能导致激酶的活性水平的增加,尽管理解锰不是生理状态抗衡离子。我们希望使用NTA洞察counter-ions的影响,和关联这之前获得活动数据。
图1:脂质体-胰岛素受体复合物
莫尔文的NanoSight范围的仪器工具提供了一个独特的能力迅速描述这个研究药物发现系统通过直接观察纳米粒子悬浮(10 nm之间和2000海里)与高分辨率实时和最小的样品制备。纳米粒子跟踪分析(NTA)技术提供了一种前所未有的洞察大小分布,使用particle-by-particle粒子大小的方法。NanoSight提供视觉验证和高分辨率分析的粒子在纳米尺度范围内的大小和浓度测量。NTA提供了一个健壮的liposome-protein系统分析和揭示了这种激酶激活的方法。
挤塑脂质体和纯化蛋白从蓝天BioServices(美国伍斯特,MA)。样品被稀释在消息灵通的缓冲区分析之前NanoSight NS300配备高灵敏度滨松sCMOS相机,20 x物镜,50 mW绿色波长532纳米的激光。样品进行了分析使用NTA 3.1构建46软件。NanoSight技术观察悬浮粒子的布朗运动,通过Stokes-Einstein方程计算出它们的大小。它获取一帧一帧的基础上通过观察粒子浓度通过使用sCMOS相机(每秒25帧)。软件确定粒子的平均数量每帧的视野和计算number-weighted浓度的结果。
纳米粒子跟踪分析提供一个升值的快速动力学与高分辨率分析聚合在实时基础上。我们可以看到同时降低浓度和大小随着时间的增加锰的存在缓冲区。脂质体明显聚集在Mn(图2和图4)。分析RTK域胰岛素受体的玫瑰(或三)缓冲表明他们进一步总锰的存在(图3和4)这一分析是具有挑战性的,因为蛋白质本身似乎聚合没有学位的抗衡离子时注意初始时间曲线在图3和图4,虽然显然是一个总规模显著增加锰的存在不是观察到与添加镁。
图2:脂质体在Mn缓冲显示聚合(增加规模和减少浓度)
图3:胰岛素受体在Mn缓冲显示聚合(增加规模和减少浓度)
图4:胰岛素受体和脂质体Mn缓冲显示聚合(增加规模和减少浓度)
增加镁RTK不会引起聚合和符合先前生成的数据并没有显示出明显的活动Mg的存在1、2、5(图5和6)。
图5:脂质体在Mg缓冲显示稳定的大小和浓度
图6:胰岛素受体和脂质体在Mg缓冲显示稳定的大小和浓度
镁是生物相关的假设抗衡离子,但不会导致活动是令人费解的。添加Mg RTK和脂质体没有促进聚合但导致高细胞喜欢活动1、2、5。人们认为,脂质体的RTK组装在外面以同样的方式作为细胞内(图1)。
添加锰引起聚合在节省成本和简单的方式,增加活动,合理的再现性和鲁棒性。当RTK正确自组装在脂质体的存在镁、生物相关的抗衡离子,以下好处1、2、5:
答:增加自身磷酸化和底物磷酸化
b .催化率最高(除了自身磷酸化self-inhibitory, Tie2)
c .提高底物选择性
Template-assembled酶有望成为一个更好的筛选工具,因为目标似乎是在细胞样的构象,使一个独特的机会筛选蛋白质-蛋白质之间的关系。这项研究指出,需要更好地理解之间的差异迫使colocalization(或分子拥挤)和RTK复合物的功能组装(colocalization有趣的讨论,请参阅参考资料4)。这里给出的工作的假设是一致的锰增加一些激酶的催化活性通过促进聚合配合物的形成。
NTA是一个有用的技术,准确地描述聚合脂质体制剂在各种条件下的行为。高分辨率数据提供了一个独特的洞察这些系统的聚合动力学。结果质疑化合物的相关性选择在大规模筛选(高温超导)化验使用锰作为抗衡离子。
(1)埃斯波西托EA,乔舒亚,Weis RM。J Biomol屏幕2008;13 (8):810 - 6。
(2)乔舒亚,埃斯波西托EA,堰RM。化学生物药物洗脱支架2008;71 (3):278 - 281。
(3)朗谬尔,2007年。23(6):3280 - 9页。
(4)当今结构生物学观点》,2006年版。16(6):702 - 9页。
(5)他说,乔舒亚,埃斯波西托EA,掠夺。摩尔。生物。Transl。Sci。2010;91:209-39
TDA技术准备使用脂质体是受专利保护,可以通过蓝天Bioservices许可证:美国:8541190。
