成功开发3D细胞培养测定的7个技巧

传统的细胞研究是将细胞放置在二维表面上。虽然这些研究在推进生物医学研究方面有极大的帮助，但现在人们普遍认为，二维细胞不能忠实地代表生物体中细胞生理学的许多关键特征。毫不奇怪，这主要是因为活组织中的细胞在三维空间中进化!

在3D中，细胞被迫通过其整个表面区域与微环境(与其他细胞或细胞外基质(ECM))进行更强烈的相互作用。相比之下，在2D中培养的细胞通常有一半的表面积暴露在玻璃或塑料中，另一半暴露在介质中。

在3D中重现更复杂的微环境相互作用是至关重要的，因为我们现在知道体内细胞受到周围环境的严重影响，特别是受ECM的影响。¹值得注意的是，我们现在知道微环境可以影响细胞对药物的反应。^2、3这凸显了模拟微环境对体外药物测试的重要性。

因此，开发3D细胞模型的转变有助于创建更多与生理相关的体外模型。这有两个主要目的:更有效地在体外测试药物⁴或者在植入病人体内之前对细胞进行更好的预处理。⁵

虽然向3D细胞培养的转变在过去十年中一直在进行，但它仍在迅速发展，以满足不断增长和动态的制药需求。到目前为止，3D细胞培养依赖于无数种格式(通常是组合的)，依赖于水凝胶、生物反应器、工程支架或微流体平台的使用。⁶在这里，我们提供了一些提示，我们认为对任何进行3D细胞培养的人都是必要的。

尽早弄清楚如何让你的细胞荧光

虽然在2D中，光场成像通常足以使细胞可视化，但在3D中，由于细胞在多个平面上进化，问题变得更难解决。让你的细胞荧光可以极大地促进它们的3D可视化。获得荧光细胞并非易事。如果你的实验室有专业技术，你可以购买荧光细胞株或自己转染它们。在任何一种情况下，这些细胞将具有稳定表达荧光报告，从而永久发射荧光的优势。

如果你处理的是原代细胞，它们要么敏感，要么需要新鲜分离，每次重复转染可能不太理想。在这种情况下，可以考虑使用可以被细胞吸收的染料，使它们暂时具有荧光(例如Invitrogen公司的CellTracker)。然而，这种方法只能在很短的时间内产生荧光，并且可能对细胞有毒。如果你要转染你的细胞，用荧光对它们进行分类是个好主意，这样你就能分离出高度荧光的同质细胞群。否则，细胞之间荧光的异质性将使你很难调整成像设置来检测它们。

与此同时，仔细考虑你想要分析什么:有几种方法可以对细胞的特定区域进行染色，例如，只对细胞核、膜或整个细胞质进行染色。如果您试图分析精细的突起或膜动态，对整个细胞质进行染色可能不理想。在任何情况下，请记住，使细胞荧光会影响它们的生理机能，因此将它们与相同的非荧光细胞进行比较总是明智的。

根据成像需求选择合适的平台

有许多平台适合3D细胞培养，从传统的孔板，到生物反应器或微流体平台。为你的实验选择合适平台的一个重要标准是你的成像需求:如果你需要成像，特别是在高分辨率下，你要确保你所使用的平台提供适当的成像深度。换句话说，单元格需要足够接近目标，以实现所需的分辨率。这也适用于2D细胞培养实验，但3D细胞培养为您的实验增加了额外的深度。因此，你需要确保3D结构中的单元格现在离目标不会太远。

为你的支架选择合适的配体

在体内，细胞与构成ECM的蛋白质(称为整合素)上的粘附位点相互作用，这极大地影响了细胞的行为。¹不同的器官由不同的ECM蛋白组合组成，每个ECM蛋白由独特的整合素组组成。要决定在您的实验中使用哪种ECM(如胶原蛋白、纤维蛋白、层粘胶蛋白或基质蛋白)，一个好的起点在于确定您试图模拟的器官:例如，并非所有器官都特别富含I型胶原蛋白，如大脑。请注意，你也可以通过添加配体位点来实现聚合物的功能化，⁷或者人们可以通过混合天然和合成聚合物来创造一种混合水凝胶。天然聚合物提供生物功能，而合成聚合物提供可调的机械性能。⁸

控制支架的刚度和孔隙大小

您需要考虑细胞嵌入的基质的浓度和交联，因为这将影响它们的硬度和孔径。已知硬度和孔径会影响细胞迁移、生理和对药物的反应。不同器官的情况也不同;因此，人们应该根据他们试图重建的组织来调整这些变量。一个重要的问题是，刚度和孔径变量不是相互独立的。通常，为了增加刚性，人们会增加聚合物的浓度;然而，这很可能会减少水凝胶的孔隙大小。因此，很难单独分离这些变量的影响，尽管少数小组已经成功地做到了这一点。^9、10

想想脚手架表面的涂层

细胞对所有表面的喜爱不尽相同。虽然这对于2D细胞培养尤其重要，其中大多数细胞与表面直接接触，但它也与3D细胞分析相关。3D细胞分析可以包含细胞单层，这是更大和更复杂的组织样模型的一部分。例如，细胞被种植在聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜上，以模拟肺-空气界面。¹¹或者细胞被植入PDMS微流体通道，以重建覆盖3D水凝胶的圆柱形内皮单分子层。¹²在这些情况下，需要在这些表面预涂ECM，如纤维连接蛋白，以促进细胞附着。另外，表面涂层也可以确保水凝胶附着¹³到你的平台上去。

别忘了扩散现在很重要!

在二维单层中，你所有的细胞都暴露在介质中:它们都被平等地直接滋养和充氧。在3D中，事情会发生变化。嵌入3D支架的细胞必须依赖于介质通过支架的扩散。扩散与距离成反比。这意味着3D结构中不同深度的细胞可以暴露在不同(且不足的)营养或氧气水平下，从而建立稳定或短暂的梯度。例如，这在大型肿瘤球体中是一个众所周知的现象，由于氧气、营养物质以及二氧化碳和废物清除能力的减少，坏死核心形成。¹⁴这种类型的梯度在体内的选定过程中被发现，因此在体外繁殖可能是有趣的。然而，人们必须意识到在3D细胞培养中建立这些梯度，因为如果它们导致支架中的一些细胞营养不足，它们可能并不总是需要的。在体内，组织的血管化使靠近血管的细胞保持营养和活力。因此，除非你决定给你的3D细胞检测血管化或设计其他策略来克服缺氧，¹⁵确保你控制了构建的深度，并承认这些梯度的可能性，因为它们会影响细胞的生理机能。

保持冷静，保持简单

最重要的是，试着让你的实验尽可能简单。在目前实现最生理学相关模型的竞赛中，人们很容易被诱惑添加许多细胞类型或其他变量，即使它不能直接解决你的生物学问题。确保你尽可能用最简单的分析方法回答尽可能多的初步问题，然后再进行更复杂的实验。

参考文献

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