使用NanoLuc®的新型双荧光素酶检测实现了第二代符合报告系统，以减少HTS海报中的假命中

基于荧光素酶的报告基因检测仍然是高通量化合物筛选的基石，因为它们具有高灵敏度和动态范围。然而，由于化合物与荧光素酶报告因子的直接相互作用，可以产生大量的非相关命中。为了帮助区分调节感兴趣的生物途径的化合物与影响报告酶稳定性或活性的化合物，我们开发了第二代符合报告系统，在该系统中，转录激活导致两个具有不同化合物干扰谱的同源报告的化学计量学表达。在该系统中，萤火虫荧光素酶(Fluc)和pest失稳定NanoLuc®荧光素酶(NlucP)通过P2A肽介导的核糖体跳跃式表达在同一个启动子上。

为了在同一样品中灵敏地测量Fluc和NanoLuc (Nluc)，我们开发了Nano-Glo®Dual-Luciferase®Reporter (NanoDLR™)检测系统，这是一种以“add-read-add-read”格式执行的均质裂解检测，其中Fluc信号通过添加Nluc试剂淬灭超过百万倍。Nluc亮度的增加和Fluc抑制能力的提高意味着在现有的同质firefly/Renilla双荧光素酶测定(double - glo)中，Nluc可以在比Renilla荧光素酶低2-3个数量级的摩尔浓度下被检测到，这使得两种荧光素酶都可以成为动态报告者。在将f鲁克- a2 - nlucp生物回路单拷贝集成到与帕金森病相关的基因位点后，HTS使用NanoDLR轻松区分影响报告者之一的化合物与影响转录的化合物，使命中次数减少了5倍。