细菌培养导论

细菌是生态系统的重要组成部分。它们对我们的健康和环境至关重要，在食品生产中发挥着重要作用，并为生物工程师提供了利用其特性和制造化合物的工具。然而，它们也可能是有害的，会造成损害和疾病。因此，培养这些微生物的能力是能够利用它们的力量、识别有害的罪魁祸首并提高我们的理解和能力的重要一步。在这篇文章中，我们考虑什么是细菌培养，影响培养条件的因素，常见问题和一些众多的应用。

什么是细菌培养?

细菌培养是一种允许细菌细胞在可控的实验室条件下在培养基中或培养基上繁殖的方法。最佳复制所需的确切条件取决于目标细菌种类。

好氧培养和无氧培养的区别是什么?

大多数细菌在一定程度上可以在氧气的存在下生长有氧文化．但是为了获得最佳的生长，应该调整条件以适应目标细菌。在大气条件下发现的物种，如皮肤表面或上呼吸道，通常在氧气存在下生长良好。自然生长在低氧环境中的物种，如深伤口、脓肿或深海，通常在无氧环境中生长得最好厌氧培养．有些植物在有氧气的情况下根本不能生长，这些植物被称为专性厌氧生物．例子包括梭菌属而且拟杆菌属。¹同样地，那些在没有氧气的情况下不能生长的植物被称为专性需氧菌．用于培养目的的例子包括革兰氏阴性铜绿假单胞菌²而且结核分枝杆菌，^3.结核病的病原体然而，研究表明，在某些情况下，两者都可以进行无氧呼吸。这种细菌既可以在好氧条件下生长，也可以在无氧条件下从好氧呼吸转变为发酵或无氧呼吸兼性厌氧菌．例子包括革兰氏阳性葡萄球菌,⁴大肠杆菌（大肠杆菌)，⁵沙门氏菌⁶而且李斯特菌spp . .⁷

细菌培养方法

为了成功培养，细菌需要培养基中提供营养物质。有许多不同的配方，以适应不同的营养需求的细菌种类。的介质类型你的选择取决于文化的目的。丰富的，有营养的完整的媒体可以帮助增加纯培养物的体积，使细菌细胞处于良好的状态。最小的媒体另一方面，它只提供最基本的生存必需品，并可用于控制细菌中哪些通路被打开。

媒体也可以被归类为定义或未定义的．顾名思义，在定义的媒体中，所有的成分都是已知的。未定义的培养基往往含有比例未知的营养物质和化学物质的复杂混合物，如酵母提取物。

无论选择哪种介质，都可以是液态的肉汤文化,或琼脂可加入培养基，使细菌细胞在固体表面上生长。

文化肉汤

在液体培养基中培养，也称为肉汤培养，与静态细菌菌落相比，使细菌更容易获得有效的营养物质。温和的搅拌，以保持细菌分散通过培养基在孵化期间，可以帮助这进一步进入。液体培养基也会稀释废物，因为他们形成，分布他们通过培养。因此，相对于固体介质，在同等体积的液体中可以获得更大质量的细菌。

因此，当你想要充实你的培养时，你可能想要使用肉汤培养，例如，在食品生产中使用细菌来生产所需的化合物或从细菌中提取DNA或质粒。

当你看长期保存菌株，它们可能在液体培养基中生长。然后加入甘油，这将防止完全冻结和随后的细菌细胞裂解，允许它们储存在-80度°C.以这种方式长期储存可以保存菌株- - - - - -在长时间收集菌株时很有帮助- - - - - -防止有价值的菌株的损失，也减少了可能发生重复传代突变的风险。

营养琼脂

将琼脂添加到液体介质中，使其能够被放置在培养皿中，例如斜坡或塞中。当您希望从混合培养中选择单个菌落时，固体介质是有用的，例如在纯化诊断样品时。如果您希望枚举在给定体积的液体样品中菌落形成单位(cfu)的数量，在固体介质上电镀和孵育也允许这样做。接种在斜坡上或在斜坡中刺的文化也可以是一种方便的方法，将菌株从一个实验室到另一个实验室，而没有潜在的传染性物质泄漏的危险。

选择性和差异性介质

有选择性的媒体⁸也可用于促进或抑制具有特定特性的某些物种、物种组或菌株的生长。这可能是基于菌株利用特定营养物质的能力，产生某些副产物或对某些抗生素的耐药性。选择可用于肉汤和固体介质。

菌株生长或不生长的能力可以通过不同培养基中的颜色变化来指示，通常用于识别细菌种类或亚型。例如，通过分析剖面指数(API)测试条，细菌与一系列底物一起培养，根据其代谢产生不同的颜色变化模式，从而实现识别。

哪里有压力溶血性，血液琼脂上的生长可以评估溶血类型，有助于识别存在的物种(图1)。

图1: 血液琼脂培养显示α(左)，β(中)和γ(右)溶血。来源:Mibilehre，转载于Creative Commons Attribution-Share Alike 4.0 International许可证。

在液体培养基中加入抗生素可防止非耐药菌株的生长。这可能有助于培养一个工程菌株，其中添加了抗生素抗性基因作为标记。因此，工程未成功的污染物种或菌落的生长将被选择反对。

在制备过程中，抗生素可添加到固体培养基中，发挥与液体培养基类似的作用。另外,antibiotic-infused磁盘可放置于已接种感兴趣的污点的固体介质上。在菌株对抗生素敏感的地方，当细菌生长时，椎间盘周围会出现一个不生长的清晰区域，例如，可以选择合适的抗生素来治疗感染(图2)。

图2: 抗生素耐药性测试;左边培养物中的细菌对白纸圆盘中含有的抗生素很敏感。右边的细菌对大多数抗生素都有抗药性。图片来源:Graham beard博士，转载如下国际知识共享署名共享4.0许可证。

除了已经讨论过的氧气条件和营养需求外，不同物种生长的最佳温度和湿度也各不相同，这反映了它们的自然栖息地。通常生长在肠道或下呼吸道等身体深处的物种，在37岁时可能生长得最好°C -体温。相反，在土壤中发现的物种可能需要较低的温度。当对细菌进行遗传操作时，温度可以作为一个开关来控制对温度敏感的质粒的整合，从而促进预期的结果。

什么是细菌生长曲线?

虽然不同种类的细菌的分裂率不同，但它们在肉汤培养中通常会遵循相同的一般生长模式。培养物中细菌细胞的数量可以通过各种方法来估计，包括电镀和菌落计数，或通过测量培养物的浊度紫外可见光谱．当这个曲线(通常在对数刻度上)随时间绘制时，它被称为生长曲线，⁹如图3所示。

图3: 细菌生长曲线的例子，显示1)滞后阶段，2)指数/对数阶段，3)固定阶段和4)死亡阶段。

1. 停滞阶段 细菌正在适应新的生长环境。这一阶段的长度将取决于它们与之前的状况以及细胞状况的相似程度。细菌可能需要自我修复，产生用于复制的酶和RNA，或者合成周围环境中缺乏的分子。

2. 指数相或对数相 -一旦细胞适应了它们的环境并拥有了所需的分子，细胞分裂就正式开始了。这遵循一种可预测的加倍模式，其持续时间将取决于条件对细菌种类的适应程度。在条件接近最佳的地方，会出现快速增长，并因此出现陡坡。这是细菌细胞最健康的阶段，因此通常是细胞被用于其他实验的阶段。

3. 固定相 -营养物质耗尽，废物堆积，空间不足，进一步减缓分裂，使产生的新细胞数量与死亡细胞数量相等。这被视为增长曲线趋平。新的细菌细胞在试图适应饥饿条件时会发生生理变化。产孢物种也可能开始产孢。

4. 死亡或衰退期 -当条件不再有利于生长时，观察到细胞状态的稳定恶化导致生长曲线的下降。非活细胞仍可用于浊度测量，用于估计细胞数量，使数值高于真正活细胞的数量。通常，一些细胞在突变或进入休眠状态时始终保持活力。

获得纯净的文化

纯培养是指只含有你想要培养的细菌种类的培养。实现这一目标的容易程度可能在很大程度上取决于样本的来源、目标物种相对于其他物种的丰度以及目标物种本身。如果您的来源是另一种纯培养物或已分离并储存在冰箱中的菌株，那么培养物可能已经是纯的。然而，如果来源是临床或环境样本，则可能存在许多其他种类的细菌和潜在的真菌，它们也会在培养条件下愉快地生长。选择性培养基和限制生长条件(如好氧培养和厌氧培养)有助于消除非目标物种，缩小范围。将样品划到固体培养基上而不是肉汤培养基上，可以从一般背景中直观地识别感兴趣的菌落。在获得纯培养物之前，可能需要将感兴趣的菌落挑选并重新条纹到新鲜的琼脂板上几次。一旦实现了这一点，如果需要，它们可以在液体培养基中生长。如果目标物种仅以较低的数量存在，则可能需要从原始样品中剥离多个板，以便将它们分离出来。有些物种比其他物种生长得更快更有活力，所以这也是一个需要考虑的因素。

根据实验目的的不同，不一定总是需要获得纯培养物。如果有可能在其他背景中识别目标物种，这就足以满足您的目的，那么可能不需要获得纯培养。然而，如果你希望，例如，进行进一步的靶向分析或细菌正在培养用于生产或食品目的，那么获得和保持纯培养可能是必要的。

细菌培养的常见问题

• 污染细菌培养物的污染可能是非常严重的问题，特别是如果它没有被发现的话。在最好的情况下，这可能意味着需要重新分离纯培养物，但在最坏的情况下，如果它发生在食品或生产环境中，可能会导致疾病和非常昂贵的补救工作。培养污染可能来自许多来源，从原始样品本身到培养甚至储存过程。好无菌技术有助于避免细菌培养物的污染。
  
  
• 某些物种的过度生长-一些细菌种类容易生长和旺盛。当试图从混合样本中分离出一个物种时，这些活力旺盛的物种可能会过度生长，掩盖了生长较慢的目标物种的存在。为你的目标物种(如果已知)使用选择性的介质和最佳的生长条件可以帮助缓解这种情况。试着在取样后尽快培养样品，以确保其尽可能具有代表性。
  
  
• 取样前进行抗生素治疗-在诊断环境中，重要的是要知道在取样前是否进行了抗生素治疗。如果是这样的话，一个特定的物种培养失败可能并不表明它不是感染的原因。
  
  
• 不正确的生长条件-使用不适当的或次优的生长条件可能会阻碍或完全阻止目标菌株的生长。一定要仔细检查生长需求，或者如果使用抗生素选择，确保为抗性基因选择了正确的抗生素。
  
  
• 不可培养的和生长缓慢的有机体-即使是现在，有些细菌种类也不能在实验室里培养。¹⁰其他的，比如分枝杆菌，¹¹生长非常缓慢，可能需要几个月的时间才能培养成功，这在试图诊断感染时尤其成问题。

细菌培养的应用

培养细菌细胞可能是必要的或可取的原因有很多。在这里，我们考虑一些常见的目的。

诊断感染

尽管从样本中分离和鉴定细菌种类需要很长时间，但细菌培养仍然是重要的诊断工具。¹²而聚合酶链反应可以快速识别特定病原体的存在，隔离罪魁祸首将确认它是活的，提醒分析人员潜在的传播风险并告知治疗。这也意味着可以进一步询问细菌菌株的信息，如抗生素敏感性，指导治疗选择。菌株也可以保存下来以供将来参考，例如用于疾病监测目的。

基因操作

操纵细菌菌株的基因组可能是可取的，原因有很多;试图了解基本的生物学，在制造疫苗菌株时减弱它，过量生产蛋白质，并创造一个有可检测标记的参考菌株，这只是其中的几个。无论是突变、删除还是插入遗传物质，培养感兴趣的品系都是基本需要¹³在基因工程之前，过程中和之后。

流行病学研究

培养和鉴定菌株对流行病学研究至关重要。¹⁴这使科学家能够研究细菌种群如何随时间变化- - - - - -哪些可以为治疗、疫苗和诊断的设计和更新提供信息- - - - - -并研究传播事件，从而为公共卫生政策和建议等提供信息。的淋球菌分离监测项目就是这样一个项目，监测菌株的抗生素耐药性，帮助提供药物治疗建议。美国疾病控制和预防中心(CDC)也负责活性细菌核监测(abc)系统，提供基于实验室和人群的对具有公共卫生重要性的侵入性细菌病原体的监测。

扩大规模以支持组学研究

虽然DNA和RNA的测序可以用少量的遗传物质进行，即使是在单细胞水平上，但在许多研究中，下一代测序(NGS)仍然是在许多细菌细胞的材料上进行的，因此，细菌通常需要在提取DNA或RNA之前进行培养。¹⁵如果你对一个特定的菌株感兴趣(不像微生物组的研究，将包含混合)，那么这可能来自一个纯培养。

开发疫苗和治疗方法

为了对抗细菌病原体，你通常也需要能够培养病原体。在研制疫苗的过程中，¹⁶培养菌株以了解它们的基因组、放大它们的基因或操纵它们可能是必要的。同样，为了测试候选疫苗或疗法，经常需要进行挑战性实验¹⁷在这个实验中，个体受到病原体的挑战，以观察治疗是否有效。为此，通常培养细菌菌株，并在定义的挑战模型中枚举，以控制和确定受试者接受的剂量。

食品饮料生产

细菌是人体的重要组成部分多种食品的生产广泛分为益生菌和发酵剂。

益生菌的培养通常是为了对人体健康有益，¹⁸通常是通过我们的肠道微生物群。虽然益生菌可能含有许多不同的细菌种类，乳酸菌而且双歧杆菌属是文化的常见选择。

另一方面，发酵剂通常用作食品生产过程的一部分，以提高风味、质地、营养价值或提高保鲜性。例子包括酵母面包意大利香肠,¹⁹意大利辣香肠和火腿干。乳酸菌(LAB)在发酵剂中很常见。然而，有些食物和饮料可以说可以同时属于这两个阵营，比如酸奶和越来越受欢迎的泡菜^20.而且康普茶在那里，人们食用产品是为了其风味和益生菌的益处。

无论培养的目的是什么，保持健康、无污染的文化对最佳生产和消费者安全至关重要。

检测食物污染物

虽然有些细菌在食品生产中可能是可取的，但它们也可能作为污染物存在，并具有可能导致严重的食源性疾病．常见原因包括沙门氏菌sp。单核细胞增多性李斯特氏菌，空肠弯曲杆菌而且大肠杆菌．因此，分析人员能够从食物样本中培养出任何潜在的危险细菌是很重要的，即使它们的数量很少。

参考文献

1.Garrett WS, Onderdonk AB. 249 -拟杆菌，普氏菌，Porphyromonas,梭菌属种类(和其他医学上重要的厌氧革兰氏阴性杆菌)。收录:班尼特JE，多林R，布拉泽MJ，编辑。曼德尔、道格拉斯和贝内特的《传染病原理与实践》(第八版)．桑德斯。b;2015:2773 - 2780。doi:10.1016 / b978 - 1 - 4557 - 4801 - 3.00249 - 6

2.克雷斯波A，佩德拉兹L，阿斯托拉J，特伦兹E。铜绿假单胞菌由于厌氧生长受阻，在缺乏II类和III类核糖核苷酸还原酶的情况下，表现出缺乏生物膜的形成。前面Microbiol．2016; 7:688。doi:10.3389 / fmicb.2016.00688

3.史密斯我。结核分枝杆菌毒力的发病机制和分子决定因素。临床微生物学Rev．2003; 16(3): 463 - 496。doi:10.1128 / cmr.16.3.463 - 496.2003

4.哈里斯L，福斯特S，理查兹R.介绍金黄色葡萄球菌，以及识别和量化的技术金黄色葡萄球菌黏着素与生物材料黏附的关系:综述。eCM．2002; 4:39-60。doi:10.22203 / eCM.v004a04

5.冯武芬，刘志强，李志强，等。厌氧过渡的研究进展大肠杆菌培养到好氧:在需求导向的动态通量平衡分析中平衡mRNA和蛋白质水平。《公共科学图书馆•综合》．2016; 11 (7): e0158711。doi:10.1371 / journal.pone.0158711

6.李文杰，李志强，李志强，等。如何沙门氏菌在有氧条件下氧化H2。2月的信．2012, 586(5): 536 - 544。doi:10.1016 / j.febslet.2011.07.044

7.伦古B，里克SC，约翰逊MG。生长、存活、增殖及发病机制单核细胞增多性李斯特氏菌在低氧或厌氧条件下:综述。厌氧生物．7 - 17 2009; 15(1 - 2):。doi:10.1016 / j.anaerobe.2008.08.001

8.本尼特M，拉吉尔JC，拉乌尔D, Khelaifia S.细菌培养通过选择性和非选择性条件:培养基在临床微生物学中的进化。新微生物新感染．2020; 34:100622。doi:10.1016 / j.nmni.2019.100622

9.麦尔RM。第三章:细菌生长。入:Maier RM, Pepper IL, Gerba CP环境微生物学．文献出版社。2000:37-54。国际标准图书编号:978-0-12-497570-5

10.鲍铎A，鲍德朱姆N，文泽GE等。不可培养细菌的挑战:环境观点．环境科学生物技术19,1 - 22(2020)。doi:10.1007 / s11157 - 020 - 09522 - 4

11.Pfyffer GE, Wittwer F.分枝杆菌培养的孵育时间:多长时间足够向临床医生出具最终阴性报告?临床微生物学．2012; 50(12): 4188 - 4189。doi:10.1128 / JCM.02283-12

12.Giuliano C, Patel CR, Kale-Pradhan PB。细菌培养鉴定和结果解释指南。P T．2019年,44(4):192 - 200。PMC6428495

13.王志刚，王志刚，王志刚。细菌基因工程的研究进展。前面。Microbiol．2020; 11:2161。doi:10.3389 / fmicb.2020.548410

14.帕克希尔J, Wren BW。细菌流行病学和生物学——基因组测序的经验教训。基因组医学杂志．2011; 12(10): 230。doi:10.1186 / gb - 2011 - 12 - 10 - 230

15.高塔姆SS, KC R, Leong KW, Mac Aogáin M, O 'Toole RF。人类细菌病原体全基因组测序的逐步初学者方案。J生物学方法．2019; 6 (1): e110。doi:10.14440 / jbm.2019.276

16.Giesker K, Hensel M.细菌疫苗。:生物医学科学参考模块．爱思唯尔;2014.doi:10.1016 / b978 - 0 - 12 - 801238 - 3.00141 - 0

17.王志强，王志强，等。一种受控制的人感染模型酿脓链球菌咽炎(CHIVAS-M75):一项观察性、剂量发现研究。柳叶刀微．2021; 2 (7): e291-e299。doi:10.1016 / s2666 - 5247 (20) 30240 - 8

18.Bazireh, Shariati P, Azimzadeh Jamalkandi S, Ahmadi A, Boroumand MA。新型益生菌的分离乳酸菌而且肠球菌来自人类唾液和粪便来源的菌株。前面Microbiol．2020; 11:3064。doi:10.3389 / fmicb.2020.597946

19.尹志勇，金丹，金eb，李sk，李敏，张安。含泡菜粉猪肉腊肠的品质及乳酸菌多样性。韩国J食品科学Anim资源．2018年,38(5):912 - 926。doi:10.5851 / kosfa.2018.e24

20.宋海峰，王永华，金杰，等。在泡菜发酵过程中，原料中的微生物生态位决定了微生物群落的组成。食品化学．2020; 318:126481。doi:10.1016 / j.foodchem.2020.126481