介绍电穿孔转染的工具和感应细胞生成

电穿孔,也叫做electropermeabilization,是一种高效、病毒性交付系统,允许的遗传物质(DNA和RNA),蛋白质、药物或其他分子进入细胞。它使用一个精确的脉冲电流来创建临时毛孔的细胞膜的分子可以通过。这个过程可以用在多种细胞包括哺乳动物,¹昆虫,²酵母,³植物⁴和细菌细胞。⁵

一旦进入,药物和其他分子可能对细胞行为。遗传物质可能保持独立(质粒)或成为整合到宿主基因组根据下游实验步骤。虽然电穿孔,在1972年第一次描述了⁶但直到1982年才命名,⁷已经被用作在体外工具多年,在1991年,第一个在活的有机体内电穿孔⁸被用来传递遗传物质和现在正在研究的可用于基因和细胞疗法的一系列条件。从那时起,技术也已发展到提供电穿孔在子宫内在老鼠身上⁹和其他实验动物蛋中蛋在鸡和蛇。¹⁰

电穿孔是如何工作的呢?电穿孔机和电穿孔比色皿

当一个细胞能够接受免费的DNA或RNA,它被称为“主管”。一些类型的细胞或微生物物种,如枯草芽孢杆菌,¹¹天生的能力和他们可以诱导吸收营养浓度诱导DNA通过开关压力。许多细胞,然而,不自然的主管或只能吸收某些材料,如抗菌素耐药性磁带,在特定的条件下,在实验室繁殖是复杂的。化学物质可以用来诱导能力在一些物种,如大肠杆菌(大肠杆菌),¹²但是,这并不适用于所有类型的细胞或微生物物种。相反,细胞电穿孔的过程可以使non-competent主管和服从实验操作。

为在体外电穿孔,暂停目标细胞与分子在导电溶液混合你想介绍进入细胞和放置在一个小池(图1)。电穿孔比色皿有金属板两侧的样品室允许电流通过混合物。试管放入一个室的electroporator相应的电触点,使试管形成一个电路。电穿孔机器上的控件允许用户设置电压、波形和持续时间的电脉冲,应优化目标细胞类型。然后通过电子脉冲的样品室。

图1: 一个图表的主要组件的electroporator试管加载。信贷:理查德·惠勒下重现GNU自由文档许可证。

电子脉冲干扰细胞膜的磷脂双分子层,¹³导致毛孔形成(图2)。这发生不对称与毛孔形成第一阳极一侧的细胞。与此同时,跨膜电势的增加。这促使带电分子,如DNA,吸附膜,第一阴极一侧的细胞,通过这些毛孔和进入细胞¹⁴(图3)。细胞壁,存在于植物细胞和一些细菌,是一个主要为大分子进入细胞的运动障碍。因此,原生质体(细胞的细胞壁被移除)通常用于电穿孔,^4,15尽管与壁细胞电穿孔的方法完整的开发。¹⁶

图2: 示意图显示破坏细胞膜电穿孔和孔隙的形成。

电脉冲通过后,毛孔开始重新封装。¹⁷率¹⁸在这发生变化从细胞到细胞,但通常是在该地区的毫秒数分钟。在这个阶段,细胞是微妙的,必须认真对待,直到有一个机会鸿沟。

图3: 原理图显示的步骤和相关费用在电穿孔导致的引入外源物质进入细胞,在这种情况下一个质粒。

例如电穿孔协议

当建立一个电穿孔的协议,是很重要的选择参数¹⁹使透化作用,同时可以最大限度减少干扰细胞膜细胞生存能力,实验重现性和效率。考虑因素包括:

• 波形
• 脉冲时间
• 磁场强度

脉冲通常归入方波或指数衰减波。设置电压方波脉冲迅速上升,保持水平,然后迅速切断脉冲结束。与指数衰减波另一方面,电压迅速上升到目标价值,然后允许随着时间下降。方形波通常用于哺乳动物细胞,而指数衰减波更经常用于细菌、酵母、昆虫和植物细胞以及某些类型的哺乳动物细胞。而转染可能与波形在不同的细胞类型,转换效率往往很低在细菌使用方波,酵母和昆虫细胞和指数衰减波往往会减少许多哺乳动物细胞的可行性。¹⁹

脉冲的持续时间(通常微毫秒)可以直接输入方波。然而,随着指数衰减波,但这不是一个预定值,影响其他实验条件由于波的性质。相反,脉冲长度是指的“时间常数”(TC)和时间的长度是电脉冲衰变到三分之一的原始电压(图4)。效率通常是最佳的TC为5.0左右- - - - - -5.1细胞像大肠杆菌值为4.0- - - - - -5.0被认为是相当正常的。然而,从这个值效率进一步降低。低时间常数可以通过诸如质量差引起的DNA,清洗不足或过于密集的细胞样本。更高的时间常数可以表明,毛孔打开太久,可能会导致更高的细胞死亡。

图4:图显示了减少电压与时间常数的指数衰减波(T)表示的电压达到三分之一的初始值。

如果脉冲长度增加,电压通常是减少反之亦然帮助防止细胞受到不可挽回的损伤。

的磁场强度是交付的电压测量电极间距和kV /厘米。比色皿可用不同的差距大小,所以重要的是要考虑这个当优化你的电压。如果所需的磁场强度,可以计算任何电池所需的电压大小使用以下方程:

其他因素会影响成功包括细胞所需的磁场强度大小(小细胞通常需要更高的电压给定的电极间距)和温度(高电压通常需要在冷却器的温度)。

与细菌电穿孔,一般较短的效果最好,高电压脉冲(数百数千伏特微-毫秒),electroporating从高等生物细胞或组织通常需要温和的条件。^20.许多electroporators提供的预设程序的特定细胞类型已经优化。

虽然对许多细胞类型单脉冲是充分的,一些细胞类型需要两个或两个以上的脉冲,通常在预设时间间隔自动由multi-electroporator交付。

让我们考虑一个例子细菌电穿孔的协议。

1. 成长一个健康的文化细胞。菌株,mid-exponential阶段文化正积极将是一个好的经验法则。对于一些细胞,如菌株产生大量透明质酸胶囊,额外的酶可能需要添加到增长媒体把胶囊提高流程效率。
   
2. 细胞需要免费另有周围的电流会通过盐溶液中当电脉冲。因此,洗细胞去除盐;冰冷的0.5蔗糖可以是一个不错的选择。当造粒细胞移除增长媒体和洗,温柔地对待他们,用冷冻离心机减少细胞损伤。洗后,让他们在冰上,轻轻的在resuspend相同的蔗糖溶液。
   
3. 以及冷却清洗和细胞,将试管和物质上介绍了冰让事情一样冷越好。
   
4. 吸管洗细胞到试管轻轻地添加物质引入,轻轻移液混合。
   
5. 把试管放在electroporator之前,确保它是彻底的干。甚至几滴水在外面会导致电子短路,会破坏你的实验(和产生声巨响!)。
   
6. 交付电脉冲并检查时间常数是在预期的参数。
   
7. 添加冰冷的媒体细胞,让他们温暖的恢复到正常生长温度的孵化器。防止突然的冲击,因为这可以增加细胞死亡和减少实验的效率。
   
8. 一旦他们温暖和积极再次分裂(这取决于培养细胞类型或应变),细胞可以培养正常。在这一点上,促进经济增长的细胞选择性代理采取了目标物质在那些没有可以介绍他们是否正在使用。

虽然对许多细胞系,冷却器实验温度可以提高细胞存活率和实验成功,有些细胞,这并非如此。^21,22因此重要的是要优化任何协议来满足您的特定的细胞。

而电穿孔历来是进行细胞悬浮,现在也可以执行对贴壁细胞电穿孔。²³这可能是非常有用的在处理细胞培养它可能是可取的,以避免胰蛋白酶化。

细胞电穿孔转化,使细菌主管electroporator

有许多原因可能期望控制细菌细胞的基因组成。例如,:

• 创建一个工程应变的一种细菌疫苗
• 阐明基因功能
• 插入一个质粒编码标签允许细胞被跟踪
• 工程师在基因编码一个理想的产品为了使用迷你蛋白质工厂

许多细菌基因工程协议的关键部分,然而,依赖于提供修改后的遗传物质进入细菌细胞。对菌株不自然地能力,电穿孔使之成为可能。²⁴DNA,经常在质粒的形式,可以进入细胞。在细菌中,这个过程被称为转换。的选择意味着细胞已经成功地改变了通常被纳入这些质粒,如抗生素抗性基因。一旦细胞被允许恢复电穿孔,他们可能会被培养的选择性的代理,所以那些没有成功了目标DNA杀死了,而那些有生存和复制。包含目标质粒的细胞被称为转化株。根据下游应用,质粒可以保持独立,或随后可能采取措施整合质粒进入细菌基因组。

电穿孔转染真核细胞——电穿孔

在细菌、细胞核酸引入的过程称为转换,这在真核细胞称为转染²⁵与细菌可以通过使用电穿孔。以及允许科学家工程师真核细胞本身²⁶或介绍其他分子,工程师病毒转染还可以作为手段²⁷帮助理解他们的发病机理,生物学²⁸并创建修改菌株接种的目的。

细胞,细菌可以直接electroporated和工程,然而,基因工程的过程是不同的病毒。宿主细胞,如哺乳动物或昆虫细胞,病毒感染目标,正是这些宿主细胞进行电穿孔引入所需的遗传物质在病毒复制然后被整合。

其他用途的电穿孔

在活的有机体内基因治疗

与许多基因操作技术,基因疗法^29日需要提供额外的一种手段,修改或“固定”对他们的靶细胞遗传密码或灭活基因问题。有很多被调查的方法,包括使用病毒基因转移、纳米颗粒和电穿孔的治疗条件包括遗传性视网膜营养不良。^30.

不可逆电穿孔

电穿孔时我们已经讨论了在这里被认为是可逆电穿孔和膜孔形成瞬态,不可逆电穿孔也被用于癌症治疗^31日作为一个技术实体肿瘤的切除。³²像可逆电穿孔,目前应用于细胞,导致毛孔膜中出现。然而,在这种情况下,目的是破坏细胞内稳态,导致肿瘤细胞死亡。也有证据表明,细胞内肿瘤抗原作为的释放原位“肿瘤疫苗”,提供一个有前途的免疫调节治疗方面。³³

在子宫内电穿孔

作为一种工具来研究开发过程,提供质粒DNA的能力,例如编码标记蛋白质,³⁴特定的细胞在胎儿发育吸引了大量关注,特别是神经科学社区(ref 2)。^35,36在2001年第一次成功地执行,⁹在子宫内电穿孔被用来回答树突和突触连接增长³⁴和细胞命运和在开发过程中迁移。³⁷到目前为止,它还没有被用于运载人类胎儿的基因治疗。

电穿孔疫苗和药物输送

电穿孔时通常是与交货相关遗传物质的细胞,它也可以用来使药物和疫苗³⁸交付。这提供了访问大型或疏水物质,否则无法有效地穿过皮肤。³⁹它已经被用于皮肤和皮肤给药^40,41条件包括癌症。⁴²DNA疫苗⁴³对炭疽、瘟疫、⁴⁴人类乳头瘤病毒(HPV)⁴⁵SARS-CoV-2,⁴⁶等,也被开发出来,利用这种模式交付的大多数哺乳动物细胞都不是自然主管和直接注入裸DNA疫苗已取得了有限的成功。

常见问题与电穿孔

• 电穿孔参数——正确的电穿孔的条件⁴⁷可能会非常棘手,需要优化在处理一个新的细胞系或压力。如果条件太苛刻,细胞可能会永久损坏,降低细胞生存能力和转换/转染率。太温和,它可能不会创建有效的毛孔,也减少了成功率。
  
• 缓冲条件——最好的缓冲⁴⁷你的细胞电穿孔将取决于你的目标,应该优化。
  
• 细胞数量和质粒/组件引入细胞——重要的是,适当的和平衡的细胞数量和外源性物质引入到细胞。过于高细胞密度会导致电弧而太少的细胞将减少实验成功。太少质粒/组件引入到细胞的数量相比,现在也会减少潜在的实现效率。再一次,这是需要优化。
  
• 电池的质量——如果细胞用于实验开始时并不处于良好状态,这将产生负面影响实验成功。试图确保他们健康,无污染,积极改善复苏post-electroporation划分。细胞的通道数量可能会少工作有效所以如果可能的话,应该避免。过于激烈的移液还可以破坏细胞。
  
• 插入的核苷酸/组件质量——质量差或核苷酸样品污染将减少转换/转染效率,可以减少细胞的生存。高含盐量和大质粒(超过10 kb)也可能降低实验效率,所以应该考虑在规划实验。
  
• 的细胞——细胞电穿孔后的恢复期间,要小心使用。不这样做会增加细胞死亡。
  
• 灭弧——在冰上保持组件是一个很好的方式来保持冷却和保护你的细胞电穿孔过程。然而,未能完全干燥室的试管,然后将它可能会导致短路,导致实验失败和潜在的破坏性设备。室,以及水分残留盐,细胞密度过高或泡沫,例如从过于激烈的移液,也可能导致电弧发生在电池室。确保盐是彻底删除,细胞密度进行优化-检查制造商的建议指导,当添加和混合组件,温柔地这样做。这将有助于防止泡沫和减少对细胞的破坏。

引用

1。Chicaybam L, C Barcelos, Peixoto B, et al。一个高效电穿孔哺乳动物细胞的基因修改的协议。前面。Bioeng。Biotechnol。2017;4。doi:10.3389 / fbioe.2016.00099

2。曼SG,国王。有效使用电穿孔转染与杆状病毒昆虫细胞的DNA。J创性研究。70年1989;12 (Pt): 3501 - 3505。doi:10.1099 / 0022-1317-70-12-3501

3所示。Benatuil L,佩雷斯JM,贝尔克J,谢长廷厘米。一种改进的酵母转化方法的产生非常大的人类抗体库。蛋白质中。Des,选取。2010;23 (4):155 - 159。doi:10.1093 /蛋白质/ gzq002

4所示。贝茨瓦。26章电穿孔植物原生质体和组织。:加尔布雷斯DW, Bourque DP Bohnert HJ, eds。方法在细胞生物学。卷50。在植物细胞生物学方法。学术出版社;1995:363 - 373。doi:10.1016 / s0091 - 679 x(08年)61043 - 2

5。Chassy BM, Mercenier弗里金格j .转换电穿孔的细菌。生物科技趋势》。1988;6 (12):303 - 309。doi:10.1016 / 0167 - 7799 (88)90025 - x

6。诺伊曼E, Rosenheck k .渗透率变化引起的电冲动在多孔膜。J Membrain。1972;10 (1):279 - 290。doi:10.1007 / BF01867861

7所示。诺伊曼E, Schaefer-Ridder M,王Y, Hofschneider博士基因转移到老鼠lyoma细胞电穿孔在高电场。EMBO J。1982;1 (7):841 - 845。doi:10.1002 / j.1460-2075.1982.tb01257.x

8。Titomirov AV Sukharev年代,Kistanova E。在活的有机体内电穿孔和稳定的新生小鼠皮肤细胞转化质粒DNA。Biochim Biophys学报- Struc Exp基因。1991,1088 (1):131 - 134。doi:10.1016 / 0167 - 4781 (91)90162 - f

9。齐藤T, Nakatsuji n高效基因转移到胚胎小鼠大脑使用在活的有机体内电穿孔。Dev医学杂志。2001,240 (1):237 - 246。doi:10.1006 / dbio.2001.0439

10。Cardenas,博雷利诉一个协议蛋中蛋前脑电穿孔的鸡肉和蛇胚胎研究的发展。明星Protoc。2021;2 (3):100692。doi:10.1016 / j.xpro.2021.100692

11。拉姆R, Morabbi Heravi K, Altenbuchner j . super-competent的建设枯草芽孢杆菌168年使用PmtlA-comKS诱导录音带。前面。Microbiol。2015;6。doi:10.3389 / fmicb.2015.01431

12。绿色R,罗杰斯EJ。化学转换大肠杆菌。方法Enzymol。2013;529:329 - 336。doi:10.1016 / b978 - 0 - 12 - 418687 - 3.00028 - 8所示

13。从事DP。电穿孔的分子基础。BMC生物化学。2004;5 (1):10。doi:10.1186 / 1471-2091-5-10

14。Kandušer M, Miklavčičd电穿孔在生物细胞和组织:概述。:电工学从食物中提取植物和生物材料。食品工程系列。施普林格;2008:1-37。doi:10.1007 / 978 - 0 - 387 - 79374 - 0 - _1

15。贝茨瓦。植物通过原生质体电穿孔转化。:大厅RD ed。植物细胞培养协议。分子生物学方法^TM。胡玛纳出版社;1999:359 - 366。doi:10.1385 / 1 - 59259 - 583 - 9:359

16。Furuhata Y,酒井法子,村上T,等。一种方法使用电穿孔Cre重组酶的蛋白质交付到培养拟南芥与一个完整的细胞细胞壁。Sci代表。2019;9 (1):2163。doi:10.1038 / s41598 - 018 - 38119 - 9

17所示。Saulis g .孔隙消失在一个细胞电穿孔:理论与实验仿真和比较。Biophys J。1997,73 (3):1299 - 1309。doi:10.1016 / s0006 - 3495 (97) 78163 - 3

18岁。Saulis G, Venslauskas女士,Naktinis j .孔隙动力学在细胞膜电穿孔后再密封。J Electroanal。化学。界面Electrochem。1991年,321 (1):1-13。doi:10.1016 / 0022 - 0728 (91)85564 - 6

19所示。乔丹等,柯林斯M, Terefe J, Ugozzoli L,卢比奥t优化小学和其他difficult-to-transfect细胞电穿孔条件。J Biomol科技。2008;19 (5):328 - 334。PMC2628074

20.通过电穿孔转染哺乳动物细胞。Nat方法。杂志2006;3 (1):67 - 68。doi:10.1038 / nmeth0106 - 67

21。你问,阴J,傅J, et al .室温electrocompetent细菌细胞DNA转换和recombineering效率的提高。Sci代表。2016;6 (1):24648。doi:10.1038 / srep24648

22。病房BJ,柯林斯DM。电穿孔在升高的温度下大幅提高转换效率增长缓慢的分枝杆菌。《。列托语。1996,145 (1):101 - 105。doi:10.1111 / j.1574-6968.1996.tb08563.x

23。Raptis L, Vultur布劳内尔霍奇金淋巴瘤,et al .附着细胞电穿孔原位研究信号转导和gap交界的沟通。李:S,艾德。电穿孔协议:临床前和临床基因药物。分子生物学方法^TM。胡玛纳出版社;2008:173 - 189。doi:10.1007 / 978 - 1 - 59745 - 194 - 9 - _12

24。Chassy BM, Mercenier弗里金格j .转换电穿孔的细菌。生物科技趋势》。1988;6 (12):303 - 309。doi:10.1016 / 0167 - 7799 (88)90025 - x

25。波特H,海勒r .通过电穿孔转染。咕咕叫Protoc杂志。章:单元2003;9.3。doi:10.1002/0471142727. mb0903s62

26岁。Chicaybam L, C Barcelos, Peixoto B, et al。一个高效电穿孔哺乳动物细胞的基因修改的协议。前面。Bioeng。Biotechnol。2017;4。doi:10.3389 / fbioe.2016.00099

27。罗素助教,Stefanovic T, Tscharke直流。工程infection-transfection单纯疱疹病毒的方法包括复合网站针对CRISPR / Cas9核酸酶。J性研究方法。2015;213:18-25。doi:10.1016 / j.jviromet.2014.11.009

28。霍夫曼E,诺伊曼G, Kawaoka Y, Hobom G,韦伯斯特RG。DNA转染系统从八代的甲型流感病毒质粒。PNAS。2000,97 (11):6108 - 6113。doi:10.1073 / pnas.100133697

29。Prud GJ,格林卡的Y,汗,Draghia-Akli r . Electroporation-enhanced病毒基因转移的预防或治疗免疫、内分泌和肿瘤疾病。咕咕叫其他基因。2006;6 (2):243 - 273。doi:10.2174 / 156652306776359504

30.威胁L, Cordeddu V, Gaddini L,等。基因治疗视网膜营养不良。Int J摩尔Sci。2019;20 (22):5722。doi:10.3390 / ijms20225722

31日。米勒L, Leor J, Rubinsky b .癌细胞与不可逆电穿孔消融。抛光工艺Res治疗癌症。2005;4 (6):699 - 705。doi:10.1177 / 153303460500400615

32。Ruarus啊,Vroomen LGPH Geboers B,等。经皮不可逆电穿孔在局部晚期和复发性胰腺癌(PANFIRE-2):多中心,前瞻性随访时间,第二阶段的研究。放射学。2020,294 (1):212 - 220。doi:10.1148 / radiol.2019191109

33。韩张N,李Z, X, et al。不可逆电穿孔:一个新兴的免疫调节治疗实体肿瘤。前面。Immunol。2022;12。doi:10.3389 / fimmu.2021.811726

34。张L,斯坦利·SA Bordey双在子宫内电穿孔在老鼠操纵两个特定发展中皮层神经元的数量。前面。Bioeng。Biotechnol。2022;9。doi:10.3389 / fbioe.2021.814638

35。Yamashiro K, Ikegaya Y,松本N。在子宫内电穿孔的操纵特定的神经元数量。膜。2022;12 (5):513。doi:10.3390 / membranes12050513

36。齐藤t .第三章——胚胎在活的有机体内电穿孔的老鼠。下午:Wassarman索里亚诺点,eds。方法酶学。第477卷。指导在鼠标技术发展,B部分:鼠标分子遗传学,第二版。学术出版社;2010:37-50。doi:10.1016 / s0076 - 6879 (10) 77003 - 8

37岁。松香JM, Kurrasch DM。在子宫内电穿孔诱导细胞死亡和胚胎小胶质细胞形态学改变和表达签名在发展中下丘脑。J神经炎症。2018;15 (1):181。doi:10.1186 / s12974 - 018 - 1213 - 6

38。Keane-Myers,贝尔m . electroporated DNA疫苗的发展。李:年代,Cutrera J,海勒R, Teissie J, eds。电穿孔协议:临床前和临床基因药物。分子生物学方法。施普林格;2014:269 - 278。doi:10.1007 / 978 - 1 - 4614 - 9632 - 8 -大于

39岁。普劳施尼先生,Bose VG,兰格R,韦弗JC。电穿孔的哺乳动物皮肤:一种机制来提高透皮给药。《美国国家科学院刊年代。1993;90 (22):10504 - 10508。doi:10.1073 / pnas.90.22.10504

40。读出BM, Layek B,辛格j .电穿孔真皮和透皮给药。:Dragicevic N,即Maibach H, eds。经皮渗透增强剂渗透增强的物理方法。施普林格;2017:105 - 122。doi:10.1007 / 978 - 3 - 662 - 53273 - 7 - _7

41岁。Yarmush毫升,Golberg,爵士š一个G, Kotnik T, Miklavč我čd . Electroporation-based医学技术:原理、应用程序和挑战。为基础。启生物医学。英格。2014年。16:295 - 320 doi:10.1146 / annurev - bioeng - 071813 - 104622

42。Łapińska Z, Szwedowicz U, Choromańska Saczko j .电穿孔和electrochemotherapy妇科和乳腺癌治疗。分子。2022;27 (8):2476。doi:10.3390 / molecules27082476

43。Chiarella P,法齐奥VM,西格诺里E。DNA疫苗通过Electrogene转移。IntechOpen;2011年。doi:10.5772/17648

44岁。Albrecht MT、利文斯顿BD Pesce JT,贝尔MG, Hannaman D, Keane-Myers。电穿孔多价DNA疫苗的鸡尾酒抒发对炭疽和瘟疫的保护性免疫反应。疫苗。2012;30 (32):4872 - 4883。doi:10.1016 / j.vaccine.2012.04.078

45岁。太阳Y,彭年代,邱J, et al .阴道内的HPV DNA疫苗接种与当地电穿孔诱发CD8 + t细胞免疫反应对cervicovaginal肿瘤和抗肿瘤效果。其他基因。2015;22 (7):528 - 535。doi:10.1038 / gt.2015.17

46岁。史密斯扶轮基金会,帕特尔,拉莫斯,et al, DNA疫苗的免疫原性COVID-19候选人。Nat Commun。2020;11:2601。doi:10.1038 / s41467 - 020 - 16505 - 0

47岁。林Sherba JJ Hogquist年代,H,山JW, Shreiber DI,锥盘JD。电穿孔的影响缓冲成分对细胞生存能力和electro-transfection效率。Sci代表。2020;10 (1):3053。doi:10.1038 / s41598 - 020 - 59790 - x