PCR简介

什么是PCR?

聚合酶链式反应(PCR)是一项技术，它已经彻底改变了分子生物学和其他领域，使核苷酸序列的扩增成为可能。在这篇文章中，我们将讨论聚合酶链反应的简史及其原理，强调不同类型的聚合酶链反应及其应用的具体目的。

PCR原理和历史

1983年，美国生物化学家Kary Mullis深夜开车回家时，他灵光一闪。他在一张收据的背面写下了这个想法，这个想法最终使他获得了诺贝尔奖1993年获化学奖。这个概念很简单:在实验室试管中复制细胞中的DNA复制过程。结果是一样的:在现有DNA的基础上产生新的互补DNA链。

穆利斯使用的基础桑格的DNA测序作为他新技术的起点。他意识到重复使用DNA聚合酶会引发链式反应，导致特定DNA片段的扩增。

他的想法的基础是1976年发现的耐热DNA聚合酶，Taq从这种细菌中分离出来水生栖热菌在温泉中发现。¹TaqDNA聚合酶的最佳温度为72°C，并能长期暴露在高达96度的高温下°C，这意味着它可以容忍几个变性周期。

在人类发现Taq分子生物学家已经在尝试优化循环DNA扩增方案，但他们需要在每个循环中添加新鲜的聚合酶，因为这种酶不能承受DNA变性所需的高温。拥有耐热酶意味着他们可以多次重复扩增过程，而不需要在每个循环中使用新鲜的聚合酶，使整个过程可扩展，更高效，更节省时间。

首次描述了这种聚合酶链式反应(PCR)的使用Taq聚合酶1985年发表在《科学》杂志上。²

1993年，第一个fda批准的PCR试剂盒上市。从那时起，PCR得到了稳定而系统的改进。它已经成为改变从法医证据分析到诊断到疾病监测和基因工程。毫无疑问，它被认为是这20个国家中最重要的科学进步之一^th世纪。

标准PCR实验概述

聚合酶链反应(PCR)用于从一种复杂的起始材料混合物中扩增特定的DNA片段DNA模板．样品制备和纯化方案取决于起始材料，包括样品基质和目标DNA的可及性。通常，需要最少的DNA纯化和一些技术，如直接PCR或免提取PCR不需要预先纯化DNA或RNA。然而，PCR确实需要了解DNA片段侧面的DNA序列信息目标基因）.

从实际的角度来看，aPCR实验是相对简单的几小时内就能完成。一般来说，PCR反应需要5种关键试剂:

待扩增的DNA:又称PCR模板或DNA模板。这种DNA可以来自任何来源，比如基因组DNA (gDNA)、cDNA和质粒DNA。

DNA聚合酶:所有的PCR反应都需要一个可以在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一种常用的酶，它可以在70°C下以60个碱基/秒的速度合并核苷酸，可以扩增高达5 kb的模板，使其适用于标准PCR，没有特殊要求。新一代聚合酶正在被设计以提高反应性能。例如，一些被设计成仅在高温下激活，以减少反应开始时的非特异性扩增。另一些则包含“校对”功能，这很重要，例如，当放大序列与模板序列完全匹配非常关键时，例如在克隆期间。

引物: DNA聚合酶需要一个短的核苷酸序列来表明它们需要在哪里开始扩增。在PCR中，这些序列被称为引物，是单链DNA的短片段(大约15-30个碱基)。在设计PCR实验时，研究人员确定要扩增的DNA区域，并设计一对引物，一个在正向链上，一个在反向链上，专门位于目标区域的侧翼。引物设计是PCR实验的一个关键组成部分，应该仔细进行。引物序列必须选择靶向感兴趣的独特DNA，避免与相似序列结合的可能性。它们应该有相似的熔化温度，因为退火步骤同时发生。引物的熔化温度可能受到鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)与腺嘌呤(a)或胸腺嘧啶(T)相比的碱基百分比的影响，较高的GC含量增加熔化温度。调整底漆长度有助于在匹配底漆对时弥补这一点。避免容易形成二级结构或引物二聚体的序列也很重要，因为这将降低PCR效率。许多免费的在线工具可以帮助底漆设计。

脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs):它们是合成新DNA链的基石，包括四种基本DNA核苷酸(dATP, dCTP, dGTP和dTTP)。通常在PCR反应中加入等摩尔量的dNTPs以获得最佳的碱基掺入。

PCR缓冲:所述PCR缓冲液确保在整个PCR反应过程中保持最佳条件。PCR缓冲液的主要成分为氯化镁(MgCl₂)、三盐酸和氯化钾。MgCl₂作为DNA聚合酶的辅助因子，而tris-HCl和KCl在反应过程中保持稳定的pH值。

PCR反应通过混合上述试剂并将管置于热循环器中在单个管中进行。

PCR扩增由三组确定的时间和温度组成步骤：变性，退火,扩展(图1)。

图1: 单个PCR循环的步骤。

这些步骤中的每一步都被称为周期，重复30-40次，，每个周期的DNA数量翻倍并获得扩增(图2)。

图2: PCR扩增DNA分子的不同阶段和周期。

让我们仔细看看每一步。

1.变性

PCR的第一步称为变性，将模板DNA加热到95度°C持续了几秒钟，分离了两条DNA链，因为它们之间的氢键迅速断裂。

2.退火

然后将反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50 - 65°然而，确切的最佳温度取决于引物的长度和顺序。它必须用每一套新的引物仔细优化。

两条DNA链可以在此温度下重新连接，但大多数不会这样做，因为混合物中含有大量过量的引物，这些引物在特定的互补位置与模板DNA结合或退火。一旦退火步骤完成，模板DNA和引物之间将形成氢键。此时，聚合酶已准备好扩展DNA序列。

3.扩展

然后将温度提高到混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常在72左右°C, 74°C在……的情况下Taq．

DNA聚合酶附着在每个引物的一端，合成新的DNA链，与模板DNA互补。现在我们有了四条DNA链而不是一开始的两条。

温度回升到94度°C和双链DNA分子——包括“原始”分子和新合成的分子——再次变性为单链。这就开始了变性-退火-延伸的第二个循环。在第二个循环的末尾，有8个单链DNA分子。通过重复30次循环，最初存在的双链DNA分子被转化为超过1.3亿个新的双链分子，每个双链分子都是由两个引物的退火位点所描绘的起始分子区域的副本。

以确定是否已被放大成功的， PCR产物可用凝胶电泳可见，显示扩增子存在/不存在、大小和近似丰度。根据应用和研究问题，这可能是实验的终点，例如，如果确定一个基因是否存在。否则，PCR产物可能只是更复杂的下游研究(如测序和克隆)的起点。

聚合酶链反应的变化

由于它们的多功能性，聚合酶链反应技术已经进化而来近年来导致了几种不同类型的PCR技术的发展。

一些最广泛使用的是:

实时定量PCR (qPCR)

最有用的发展之一是实时定量PCR或qPCR．顾名思义，qPCR是一种可以实时监测扩增过程和检测PCR产物的定量技术。²它可以用来确定目标DNA的起始浓度，在许多情况下不需要凝胶电泳。这是由于包含非特异性荧光插层染料，如SYBR®绿色，当结合到双链DNA，或DNA寡核苷酸序列特异性荧光探针，如水解(TaqMan)探针而且分子信标．探针与扩增子内的DNA目标序列特异性结合，并使用Förster共振能量转移(FRET)原理，通过一端荧光分子和另一端淬灭剂的耦合产生荧光。对于荧光染料和探针，随着目标DNA拷贝数的增加，荧光水平成比例地增加，允许实时量化放大，参考包含已知拷贝数的标准(图3)。

qPCR使用配备荧光检测系统的专用热循环器，在扩增发生时监测荧光信号。

图3:示例qPCR扩增图和标准曲线用于未知样本的拷贝数定量。

逆转录- pcr (RT-PCR)

逆转录(RT) -PCR和RT- qpcr是两种常用的PCR变体，可以在临床和研究环境中进行基因转录分析和病毒RNA定量。

RT从单链模板RNA合成cDNA的过程是什么^3.因此也被称为第一链cDNA合成。RT-PCR的第一步是在RNA模板和DNA寡核苷酸引物之间合成DNA/RNA杂交产物。催化这一反应的逆转录酶具有RNase活性，然后降解杂化物的RNA部分。随后，通过逆转录酶的DNA聚合酶活性合成单链DNA分子。高纯度和高质量的起始RNA是成功RT-PCR的必要条件。

RT-PCR有两种方法:一步RT-PCR和两步RT-PCR。在第一种情况下，RT反应和PCR反应发生在同一管中，而在两步RT-PCR中，这两个反应是分开的，并按顺序进行。

逆转录-定量PCR (RT-qPCR)

上面描述的逆转录通常也是qPCR的第一步，定量生物样本中的RNA (RNA转录物或来自病毒RNA基因组)。

与RT-PCR一样，RT-qPCR有两种定量RNA的方法:一步RT-qPCR和两步RT-qPCR。在这两种情况下，RNA首先被反转录为cDNA，用作qPCR扩增的模板。在两步法中，逆转录和qPCR扩增作为两个独立的实验依次发生。在一步法中，RT和qPCR在同一管中进行。

数字PCR (dPCR)和数字液滴PCR (ddPCR)

数字PCR (dPCR)是对原有PCR方法的另一种改进。⁴与qPCR一样，dPCR技术使用DNA聚合酶，使用引物组和探针从复杂样品中扩增目标DNA。然而，主要的区别在于PCR反应的划分和最后的数据采集。

dPCR和ddPCR是基于限制性稀释的概念。聚合酶链反应被分成大量的纳升大小的子反应(分区)。PCR扩增在每个液滴内进行。PCR后，用泊松统计分析每个液滴，以确定PCR阳性液滴在原始样品中的百分比。一些分区可能包含目标的一个或多个副本，而另一些分区可能不包含目标序列。因此，分区分为正数(检测到目标)和负数(未检测到目标)，这为数字输出格式提供了基础。

ddPCR是2011年才出现的最新技术。⁵ddPCR利用水-油乳液形成分离模板DNA分子的分区。这些液滴本质上就像一个单独的试管，在其中进行PCR反应。这项技术被用于创建敏感SARS-CoV-2测试．

微流体聚合酶链反应

微流控处理系统的微通道和微室的最新发展为一系列实际应用铺平了道路，包括在微流控芯片上通过PCR扩增DNA。

在芯片上进行PCR得益于微流体在速度、灵敏度和低试剂消耗方面的优势。这些特性使得微流控PCR在即时检测(例如诊断应用)中特别具有吸引力。从实用的角度来看，样品通过微流体通道流动，反复通过反映PCR不同步骤的三个温度区。10 μL的样品进行20次PCR循环只需要90秒。⁶随后的分析可以很容易地在芯片外进行。

PCR故障排除

不同的PCR方法都有各自的优点和缺点，这些优点和缺点会影响到它们所适用的应用⁷．表1总结了这些情况。

方法	优势	限制
聚合酶链反应	·最简单的PCR ·设备和试剂成本低 ·若干下游应用程序(如克隆)	·结果只是定性的 ·需要增加时间和错误风险的后放大分析 ·产品可能需要通过测序来确认
qPCR	·产生定量结果 ·探针的使用可确保高特异性 ·高分析灵敏度 ·周转时间短 ·消除了放大后分析的要求	·需要更昂贵的试剂和设备 ·引物和探针选择灵活性较差 ·由于扩增子的长度较小，不太适合其他下游产品确认分析(如测序) ·不适合某些下游应用，如克隆
RT-PCR和RT-qPCR	·能用于所有类型的RNA吗	·RNA易于降解 ·RT步骤可能会增加时间和污染的可能性
dPCR和ddPCR	·快 ·无DNA纯化步骤 ·提供绝对量化 ·增加了在有限的临床样本中检测靶点的灵敏度 ·高度可伸缩	·昂贵的 ·基于几个统计假设
微流体聚合酶链反应	·加速PCR过程 ·减少试剂消耗 ·能适应高吞吐量吗 ·用于即时护理应用的便携式设备 ·允许单细胞分析	·仍然是非常新的技术 ·需要大量的样品制备，以去除碎片和不需要的化合物 ·由于高温，微流体装置的材料选择受到限制

表1:不同PCR方法的主要优点和缺点。

PCR输出应用

PCR已成为现代分子生物学不可缺少的工具，彻底改变了科学研究。该技术还为分子生物学领域以外的人打开了细胞和分子过程的研究，因此也为许多学科的科学家提供了实用工具。

虽然PCR本身是一种强大的独立技术，但它也被纳入到更广泛的技术中，如克隆和测序，作为这些工作流程中一个小而重要的部分。

PCR的研究应用包括:

基因转录-PCR可以检测特定时间点细胞类型、组织和生物之间基因转录的变化。在这个过程中，RNA从感兴趣的样本中分离出来，并逆转录成cDNA。特定基因的RNA原始水平可以通过PCR扩增的cDNA数量来量化。

基因分型-PCR可以检测特定细胞或生物等位基因的序列变异。一个常见的例子是转基因生物的基因分型，例如敲除小鼠和敲入小鼠。在本应用中，引物被设计用于扩增转基因部分(在转基因动物中)或突变(在突变动物中)。

克隆和诱变- PCR克隆是一种广泛应用的技术，通过PCR扩增的双链DNA片段插入载体(例如，gDNA, cDNA，质粒DNA)。例如，这使得能够产生遗传物质被删除或插入的菌株。定点突变也可用于通过克隆引入点突变。这通常采用一种称为重组PCR其中，重叠引物被专门设计用于合并碱基替换(图4)。该技术也可用于创建新的基因融合。

图4:图示一个重组PCR的例子。

测序 - PCR可用于扩增模板DNA进行测序。用于制备测序模板的PCR类型被称为高保真PCR，能够保持DNA序列的准确性。在Sanger测序中，pcr扩增的片段被纯化并在测序反应中运行。在下一代测序(NGS)中，PCR用于文库准备阶段，DNA样本通过PCR富集以增加起始量，并用测序适配器标记以允许多路复用。桥式PCR也是第二代NGS测序的重要组成部分。

无论是作为一种独立的技术，还是作为其他方法中的主力，PCR已经改变了一系列学科。这些包括:

遗传研究-世界上大多数实验室都使用PCR。最常见的应用之一是基因转录分析⁹，旨在评估特定基因转录物的存在或丰度。它是一种通过克隆来操纵生物(动物、植物和微生物)基因序列的强大技术。这使得基因或基因片段可以被插入、删除或突变，从而在遗传标记中进行工程改造，改变表型，阐明基因功能，开发疫苗等等。在基因分型中，PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列变异。它的用途也不仅限于人类。农业植物基因分型协助植物育种家选择、提炼和改进他们的种畜。PCR也是富集测序样本的第一步，如上所述。中的大多数映射技术人类基因组计划(HGP)依赖于PCR。

医学和生物医学研究-聚合酶链反应在许多医疗应用中使用，从疾病相关基因突变的诊断测试，到感染原鉴定．PCR在医学领域应用的另一个很好的例子是产前基因检测。产前基因检测通过PCR可以识别胎儿的染色体异常和基因突变，为准父母提供关于他们的孩子是否患有某些遗传疾病的重要信息。PCR还可作为胚胎植入前遗传学诊断工具，用于筛选胚胎在体外受精(IVF)程序。

法医科学-我们独特的基因指纹意味着PCR可以用于亲子鉴定和法医调查精确定位样本来源。例如，从犯罪现场分离出来的小样本DNA可以与DNA数据库或嫌疑人的DNA进行比较。这些程序确实改变了警方调查的方式。例如，真实性测试还使用PCR遗传标记来确定肉类的来源。分子考古学也利用PCR从考古遗迹中扩增DNA。

环境微生物学与食品安全-通过PCR检测病原体，不仅在患者样本中，而且在基质中食物或水，可以是至关重要的诊断预防传染病。

从生物医学研究到法医应用，PCR是检测核酸的基准技术。卡里·穆利斯(Kary Mullis)写在路边一张收据背面的想法，后来被证明是一个革命性的想法。

参考文献

1.钱建民，郑德伟，郭丽娟。来自极端嗜热动物水生热蝇的脱氧核糖核酸聚合酶。J bacterol 1976;127(3):1550-57 doi:10.1128 / jb.127.3.1550 - 1557.1976

2.王志强，王志强，王志强，等。β -珠蛋白基因组序列的酶扩增和酶切位点分析诊断镰状细胞性贫血。科学1985;230(4732):1350 doi:10.1126 / science.2999980

3.Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HRH。实时定量PCR的基本原理。分子诊断专家评论2005;5(2):209-19 doi:10.1586 / 14737159.5.2.209

4.第二章-反转录PCR (RT-PCR)。见:Lorsch J，编。酶学方法:学术出版社，2013:67-74。doi:10.1016 / b978 - 0 - 12 - 420037 - 1.00002 - 6

5.莫理AA。数字PCR:简史。Biomol Detect Quantif 2014;1(1):1-2 doi:10.1016 / j.bdq.2014.06.001

6.Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet数字PCR与qPCR用于低丰度靶点的基因表达分析:从无意义变量到发表质量数据。科学报告2017;7(1):2409 doi:10.1038 / s41598 - 017 - 02217 - x

7.何志伟，张志伟，张志伟。微流控装置中的聚合酶链反应。芯片上的实验室2016;16(20):3866-84 doi:10.1039 / C6LC00984K

8.Garibyan L, Avashia N.聚合酶链反应。《中国皮肤科杂志》2013;33(3):1-4 doi:10.1038 / jid.2013.1

9.前卫HD，弗拉纳KE，弗里曼WM。25年的基因表达定量PCR分析。生物技术2008;44(5):619-26 doi:10.2144 / 000112776