CRISPR筛选:研究培养皿中的进化
CRISPR筛选能够快速、公正地识别与特定生物途径相关的基因。我们将探索研究人员如何使用这一前沿工具来塑造我们对生物学的理解并推进医学。
2012年，发明了CRISPR-Cas9基因组编辑技术标志着生物学的一个新时代——提供了一个强大的新工具，以精确、定向的方式改变DNA。
“CRISPR-Cas9就像DNA的剪切、复制和粘贴，”解释说纳威娜他是纽约基因组中心的核心教员，也是纽约大学的助理教授。“但这种基因编辑技术的巨大飞跃是因为它的可编程性。将Cas9编程到人类基因组的任何特定位置的能力使其能够用于大规模筛查。”
CRISPR筛选——使用CRISPR- cas系统编辑数千个基因，并在单个实验中测量这些编辑的功能影响——已迅速成为生物医学研究界流行和富有成效的工具。
Sanjana说:“在过去的10年里，我们利用CRISPR屏幕的能力，撒下了一张遗传假设的大网，并利用这张大网，精确定位了导致许多不同疾病和特征的基因。”
基于基因编辑的无偏筛选的广泛应用，正在基础生物学、癌症研究、免疫学、神经科学和许多其他领域揭示新的分子机制，并为精准医疗提供可利用的机会。
什么是CRISPR筛选?
聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9 (Cas9)系统由Cas9酶和引导RNA组成，Cas9酶在DNA中产生双链断裂，引导RNA将核酸酶带到基因组中的特定位置。当细胞试图修复损伤时，它做得并不完美——导致基因被敲除。CRISPR筛选是这项技术的一种应用，它涉及到将大量慢病毒引导rna文库输送到大量细胞中。
“每个细胞在不同的基因中都有不同的突变，这使得以一种无偏倚和大规模平行的方式研究去除基因组中的每个基因的影响成为可能，”Sanjana描述道。
虽然完全使目标基因失活的基因敲除实验是最常见的CRISPR筛选类型，但核心技术也已经过调整，可以在不永久改变DNA的情况下激活(CRISPRa)或沉默(CRISPRi)目标基因。
CRISPRa或CRISPRi使用突变的Cas9和靶向启动子区域的RNA引导来激活或抑制基因表达，解释说加布里埃尔Balmus他是剑桥大学英国痴呆症研究所的小组负责人。
在混合CRISPR筛选格式中，目标细胞受到选择性压力的挑战，例如药物治疗，随后通过测序数据分析进行评估，以确定具有积极或消极表型效应的基因变化。结果通常是对所调查的特定生物挑战赋予敏感性或抗性的基因列表。最后一步是验证任何观察到的表型变化是由于突变的特定影响。
Sanjana说:“我是混合屏幕的超级粉丝，因为它们为研究提供了一个令人难以置信的强大工具，而不需要复杂的实验室基础设施，如机器人。”“这使得单个实验者以相对直接的方式进行基因组规模的筛选成为可能。”
相比之下，阵列筛选是在多孔板中进行的，这使研究人员能够在逐孔基础上直接观察单个引导rna的影响。
“通过阵列屏幕，更容易识别使用CRISPR引入的特定突变的效果，”他说艾琳娜·纳瓦罗·格雷罗他是牛津大学目标发现研究所功能基因组学的负责人。“但它们比共用屏幕更昂贵、更耗时。”
由于每个突变都是预先定义的，因此阵列屏幕也更容易与不涉及DNA测序的读出相结合，例如成像，蛋白质组学代谢组学分析。但是最近的进展单细胞multiomics正在开辟新的可能性，以获得高含量的读出，如基因表达或表观遗传状态，从汇集的CRISPR屏幕中以前所未有的细节描述单个细胞。
使用定制的靶向CRISPR筛选识别先天免疫的遗传驱动因素
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从基因到治疗
CRISPR筛选应用治疗潜力最大的领域之一是精准医疗。确定哪些基因增强或降低特定药物的活性，为治疗前对患者进行分层提供了机会。
的第一个基因组规模的CRISPR筛选这篇论文于2014年发表，展示了这种方法在识别癌细胞中产生耐药性的突变方面的前景。在黑色素瘤模型中靶向18,080个基因和64,751个独特的指导序列的混合筛选，确定了候选基因，其损失涉及对vemurafenib的耐药性，vemurafenib是一种靶向突变蛋白激酶BRAF的药物。这些研究的结果将为更详细的患者肿瘤基因分析铺平道路，以帮助预测他们是否会从特定的治疗中受益。
“有了CRISPR屏幕，我们可以实现个性化医疗的承诺，并做出明智的治疗决定。这就像有一个基因型查找表，即特定的突变，其中每个突变都与特定的生物表型有关，”Sanjana说。
CRISPR筛选也可用于探索基因组非编码区域变化的影响。2015年，Sanjana加入了一个团队使用CRISPR指南库旨在研究突变对BCL11A红细胞增强子，一种参与控制胎儿血红蛋白表达的非编码基因组元件。
Sanjana说:“很长一段时间以来，人们一直推测，在成人体内通常关闭的胎儿血红蛋白可以为患有某些影响成人ß-血红蛋白生产的血液疾病的患者提供成人血红蛋白的替代品。”
在2021年，结果一种基因编辑疗法的临床试验BCL11A增强器发表。两名患者——一名患有ß-地中海贫血，另一名患有镰状细胞贫血——接受了基因编辑的血细胞干的输注，以重新激活胎儿血红蛋白的产生。一年多后，两人的胎儿血红蛋白表达水平都很高，不再需要输血。
Sanjana说:“临床试验中使用的CRISPR指导RNA来自我们为我们的屏幕设计的库。”“这是一个很好的例子
展示了这种方法的力量。”
利用工程细胞库加速治疗靶标验证
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克服挑战
虽然在传统的永生细胞系上进行CRISPR筛选相对简单，但在其他类型的细胞上进行类似的研究可能更具挑战性。
纳瓦罗·格雷罗说:“最大的限制之一是需要大量的细胞——特别是对于需要至少7000万到1亿个细胞的混合筛查来说——当你处理有限的患者样本时，这可能是一个真正的问题。”“另一个问题是，一些细胞类型，如巨噬细胞或神经元，很难被慢病毒感染。”
为了克服这些挑战，许多研究人员正在使用诱导多能干细胞(iPSC)，这可能代表了更相关的患者来源模型，用于研究人类疾病。例如，纳瓦罗·格雷罗的团队最近开发了一种慢病毒将CRISPR/Cas9传递到源自人类iPSC的巨噬细胞的转导方法，效率接近100%。
纳瓦罗·格雷罗说:“这为研究巨噬细胞在免疫反应、慢性炎症、神经退行性疾病和癌症进展中的作用提供了令人兴奋的新机会。”
研究神经退行性疾病的研究人员还需要找到方法来模拟衰老对细胞的影响，以便能够筛查与疾病病理相关的表型变化。例如，Balmus的团队已经使用CRISPR筛查来探索共济失调-毛细血管扩张症背后的潜在疾病机制，这是一种罕见的遗传性神经退行性疾病，由神经细胞突变引起自动取款机基因——通过将细胞暴露于活性氧中加速衰老过程。
“我们已经发现了一种转录因子基因，当它丢失时，可以挽救神经细胞的敏感性自动取款机缺乏活性氧的细胞，”Balmus说。“我们认为这种基因与疾病表型高度相关，因为它通常只在这些患者死亡的特定类型的神经元中表达。”
为你的研究选择正确的CRISPR系统
CRISPR基因编辑技术的应用日益广泛。CRISPR系统的多功能性大部分来自于CRISPR相关蛋白或Cas蛋白，即识别和切割特定DNA片段的分子剪刀。下载此应用程序说明，了解Cas9和Cas12之间的主要差异，以及什么适合您的研究。
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发现“未知的未知”
CRISPR筛选使研究人员能够以完全公正的方式快速识别与特定生物途径或疾病相关的特定基因变化。
“这是一种工具，可以让你在一道菜中进行进化，”Balmus说。“我们的一些发现非常违反直觉;我们不可能提前预测到它们。”
这项技术为研究人员提供了一种强大的工具来研究各种生物学问题，例如解剖疾病的潜在原因或识别导致药物敏感性或耐药性的基因变化。
“我喜欢在这个领域工作的原因是，它可以让你感到惊喜，”桑贾纳说。“你从这些高通量功能基因组筛查中获得的发现感是惊人的——你每天都能走进新的生物学领域。”
