探索最新的CRISPR和干细胞研究

因为CRISPR潜在的基因编辑系统在2013年被发现,他们已经在世界各地的实验室利用各种各样的应用程序。当这个基因编辑力量利用干细胞的增殖潜能,科学家水平对细胞生物学的理解,人类遗传学和医学的未来潜力。

到目前为止,使用CRISPR技术可行性编辑干细胞已经证明在两个关键领域:建模和研究人类细胞状态和人类疾病,和再生医学。¹然而,这并非没有挑战。

在本文中,我们探索的一些最新研究这些空间和科学家们采用的方法来克服这些挑战。

破译特异性基因表达中使用CRISPRi iPSC-derived神经元

部署CRISPR技术则已经臭名昭著的挑战,正如马丁•卡普曼,•卡普曼实验室在加州大学旧金山说:“CRISPR介绍DNA断裂,则可有毒,因为这些细胞有高度活跃的DNA损伤反应。”To overcome the issue of toxicity, as a postdoc in the lab of Professor Jonathan Weissman, Kampmannco-invented工具被称为CRISPR干扰(CRISPRi)的DNA切割能力CRISPR / Cas9是禁用的。²“死”Cas9(或者dCas9)仍在招募RNA DNA由一个指南。因此可以作为招聘平台运营目标蛋白质域基因组中特定的感兴趣的地方。

CRISPRi允许在转录水平基因镇压,而不是RNAi控制基因的mRNA水平。这允许研究人员在干细胞和抑制特定基因破译其功能。•卡普曼解释说:“对于CRISPRi,我们目标转录阻遏域(带域)基因的转录起始点压制他们的表情。这种廉价的方法是非常有效的,缺乏RNAi-based基因的臭名昭著的脱靶效应击倒。”

在一项研究中发表就在上个月,•卡普曼的实验室采用CRISPRi-based平台进行人类神经元来自万能干细胞的遗传屏幕:“CRISPR-based基因屏幕可以显示这些突变导致细胞缺陷机制,并揭示细胞途径我们可以针对纠正这些缺陷。这种途径是潜在的治疗靶点。”³

“我们表达CRISPRi机械(dCas9-KRAB)从基因组中安全港轨迹,它不是沉默在神经元分化。我们还开发了一种与degrons CRISPRi构造,由小分子控制的稳定。通过这种方式,我们可以诱导CRISPRi击倒感兴趣的基因在不同的时间在神经元分化。”

图片:iPSC-derived神经元。来源:•卡普曼实验室,加州大学旧金山分校。

先前的CRISPR-based屏幕专注于癌症细胞系或干细胞而不是健康的人体细胞,细胞类型特异的角色从而限制潜在的洞察人类的基因。研究者选择屏幕在基因组屏幕显示iPSC-derived神经元选择性漏洞在神经退行性疾病的机制,和收敛机制在神经精神障碍。

大规模CRISPRi屏幕发现基因是必不可少的两个神经元,则造成不同的转录组表型时撞倒了。“对我来说,最令人激动的发现之一是广泛表达基因,我们认为的看家基因在与神经元的细胞则有不同的功能。这或许可以解释为什么管家基因的突变可以影响不同类型的细胞和组织在体内以非常不同的方式,”•卡普曼说。例如,击倒的E1泛素激活酶,UBA1,导致大量基因的特异性神经元诱导,包括内质网伴侣HSPA5和HSP90B1。

这些结果表明,由UBA1触发proteotoxic应激反应在神经元而不是万能,调整建议UBA1在一些神经退行性疾病中的作用。作者指出:“平行在人类细胞的全部类型的遗传屏幕可能系统地揭示上下文相关的人类基因的角色,导致更深的机械理解他们如何控制人类生物学和疾病。”

视频来源:加州大学旧金山分校。

开发和测试使用CRISPR细胞治疗人类疾病

有几个实验室在全球范围内明显种族发展第一个临床相关,有效和安全的细胞疗法利用CRISPR基因编辑技术。

同时大量的文献表明CRISPR功效的编辑哺乳动物细胞的基因组在体外,因为在活的有机体内应用程序,特别是人类,长期严格的安全测试结果是必需的。本月,实验室的研究人员Hongkui邓教授北京大学在北京,发表了一篇论文《新英格兰医学杂志》上。⁴本文概述了学界的研究中,他们将他生CRISPR-edited干细胞移植到人类的艾滋病患者。

的基本原理研究茎回”柏林病人”,指盖雷布朗是世界上为数不多的人被治愈的艾滋病病毒。布朗接到一个人的骨髓移植的一种变异形式CCR5基因。在正常情况下,CCR5基因编码一种受体表面的白血细胞。这对艾滋病毒受体有效地提供了一个通道进入细胞。在个人的两个副本CCR5突变,受体是扭曲和限制的艾滋病毒进入细胞。

邓小平和他的同事们使用CRISPR基因编辑捐献造血干细胞和祖细胞(公司)携带一个CCR5插入或删除。他们能够实现这一目标的效率17.8%,表明基因测序。的CRISPR-edited公司被移植到艾滋病毒的病人也有白血病,需要骨髓移植,目的是根除艾滋病病毒。

“这项研究的目的是评估的安全性和可行性的移植CRISPR-Cas9-modified公司到HIV-1-positive患者血液癌症,”邓说。他继续说:“成功的基因组编辑在人类造血干细胞和祖细胞的评价三个方面包括编辑持久性、特异性和效率长期嫁接公司。”Long-term monitoring of the HIV patient found that, 19 months after transplantation, the CRISPR-edited stem cells were alive – however, they only comprised five to eight percent of total stem cells. Thus, the patient is still infected with HIV.

尽管长期生存看似低效率,研究人员鼓励安全评价方面的研究结果:“之前报道的造血干细胞和祖细胞基因疗法不太有效,因为外源DNA随机整合到基因组中,有时诱导急性免疫反应或肿瘤,”邓说。“明显缺乏临床不良事件从基因编辑和脱靶效应研究提供了初步的支持这种基因编辑方法的安全。”

”来进一步阐明CCR5-ablated的抗艾滋病影响公司,它将增加CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率的关键,提高移植协议,”邓说。

的结婚CRISPR基因编辑和干细胞研究不是只是支持治疗艾滋病毒的发展。一个正在进行的临床试验的安全性和有效性评价自体CRISPR-Cas9修改CD34 +公司治疗transfusion-dependentβ-thalassemia,遗传血液病导致血红蛋白缺乏。

治疗方法——被称为CTX001涉及提取患者的公司和使用CRISPR-Cas9修改细胞的红细胞lineage-specific增强剂BCL11A基因。转基因细胞然后注入到病人的身体,在那里他们产生大量含有胎儿血红蛋白的红细胞。目前没有结果,但报告确认参与者已经招募了审判。

一个光明的未来

我们对细胞生物学的理解和患病的状态已经被结合使用具增强CRISPR技术和干细胞。虽然这篇文章关注于当前研究的例子,等最近的。审查提供了一个全面的视图的字段和早期的研究提供的见解。⁵

在这样的评论,作者评论”毫无疑问,CRISPR / Cas9基因编辑系统具有革命性的改变了基本和转化干细胞研究。"的解决方案仍需要解决CRISPR的臭名昭著的脱靶效应技术,提高编辑效率概述邓小平和利用小说交付策略,为临床干细胞研究是安全的。

尽管如此,未来看起来明亮CRISPR stemcell-based研究。在本月发表评论,布哈里和穆勒说,“我们预计CRISPR技术越来越多地用于iPSC-derived瀑样:蛋白质功能(亚细胞定位、细胞类型特定的表达式,乳沟,和退化)可以在开发研究以及成人在本国条件下瀑样。"

引用:

1。 Jehuda,原主,Binah。2018。在诱导多能干细胞基因组编辑使用CRISPR / Cas9。干细胞的评论和报道。DOI: 10.1007 / s12015 - 018 - 9811 - 3。

2。 Qi et al . 2013。再利用CRISPR作为RNA-Guided Sequence-Specific控制基因表达的平台。细胞。DOI: 10.1016 / j.cell.2013.02.022

3所示。 田et al . 2019。CRISPR Interference-Based平台多通道的遗传屏幕在人类iPSC-Derived神经元。神经元。https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.07.014。

4所示。 徐et al . 2019。CRISPR-Edited干细胞与艾滋病毒和急性淋巴细胞白血病患者。《新英格兰医学杂志》上。DOI: 10.1056 / NEJMoa1817426。

5。 Zhang et al . 2019。CRISPR / Cas9基因编辑系统在人类干细胞:现状和未来前景。核酸分子治疗。DOI: 10.1016 / j.omtn。