离子交换色谱原理及其应用探讨

色谱法是分离感兴趣的分子，以鉴定、量化甚至提纯它们的科学。目标分子的溶解性、尺寸或疏水性等特性导致其与固定相的不同相互作用模式，或不同类型的色谱分离，如反相(RP)、尺寸排除色谱(SEC)或疏水相互作用色谱(HIC)。

什么是离子交换色谱(IEX色谱)?

离子交换色谱法，或IEX，是一类液相色谱法(LC)用于分离有机和无机分子。它特别有用的一个领域，也是本文的重点，是带电生物分子的分离，包括氨基酸、蛋白质、碳水化合物和核酸。蛋白质等分子具有独特的3D结构，因此其表面有特定的可电离基团。因此，在任何给定的pH值下，分子的净表面电荷都是唯一的。利用这一特性来分离分子，基于它们与固定相的带相反电荷的粒子的相互作用，然后通过修改流动相的pH值或离子强度从色谱柱中释放。

离子交换色谱和离子色谱的区别是什么?

在文献中，“离子交换色谱”和“离子交换色谱”离子色谱法”(IC)通常可互换使用，由于IEX的广泛使用，并指极性或离子物种的分离。然而,集成电路是一个涵盖性术语，包括IEX、离子排除色谱(IEC)和离子对色谱法．IEX涉及带电分析物优先结合到固定相的相反带电官能团，是生物分子分离中使用的主要机制。¹IEX使用含盐的缓冲液作为流动相;通过改变洗脱液的离子强度或pH值来实现分离，并使用紫外线(UV)或荧光探测器进行检测。另一方面，IC更广泛地用于无机离子、小有机酸、胺、醇、醛和碳水化合物的分离，采用IEX、IEC或IP三种模式中的任何一种。对于这些类型的分析物，电解溶液用于洗脱，抑制电导率测量是IC最常用的检测技术。

离子对色谱也可以被认为是一种分区色谱，其中感兴趣的分析物在相反电荷的试剂离子或离子配对试剂的帮助下从中性固定相洗脱。通过改变离子配对试剂在流动相中的浓度，改变被分析物的保留时间，从而导致它们的分离。

离子交换色谱法是如何工作的?

生物分子具有在溶液中电离并赋予分子特定净电荷的官能团。例如，蛋白质是由氨基酸组成的，这两个氨基酸都含有氨基(-NH₂)和羧酸(-COOH)官能团。蛋白质的三维结构决定了哪些氨基酸残基暴露在其表面。根据介质的pH值，这些残基电离，使分子表面带正电荷和负电荷。在低pH值时，更多的氨基被质子化，蛋白质分子带净正电荷。另一方面，在较高的pH值下，更多的羧酸基被去质子化，由此产生的阴离子使蛋白质分子表面带负电荷。存在于表面的电离官能团的总数决定了净表面电荷，在任何给定的pH值下，每个分子都有唯一的净表面电荷。蛋白质在其表面呈电中性等电点，这是一个特定的pH值，在这个pH值下，分子上不带净电荷。

图1显示了IEX的分离机制。当极性或带电的分析物被加载到离子交换柱，他们静电绑定到相反的带电离子存在于固定相颗粒的表面。分析物分子表面的正电荷或负电荷越大，对带相反电荷的固定相粒子的静电吸引力就越强。目标分析物的保留时间也取决于与固定相相互作用的数量。含有缓冲液和盐的水流动相通过改变pH值或离子强度来洗脱结合的分析物。

图1:通过增加洗脱缓冲液的离子强度，显示IEX中分析物分离的示意图。

IEX的流程主要有五个步骤:²

1.平衡-作为第一步，用起始缓冲液(初始缓冲液组成)清洗固定相，直到基线稳定，洗脱液pH保持恒定。这一步确保色谱柱上的可电离基团可以与带电的分析物分子相互作用。

2.示例加载-将溶解在起始缓冲液或与起始缓冲液pH相同的缓冲液中的样品注入色谱柱。调整缓冲液的pH值和离子强度，使分析物与色谱柱结合，而杂质不结合。

3.洗-再次用启动缓冲液清洗色谱柱，以去除不带电的分子以及与固定相具有相同电荷的分子。一旦杂质被冲走，基线就会稳定下来。

4.洗脱-盐梯度用于洗脱结合分析物，因为洗脱缓冲液中的离子竞争并取代柱表面带电位点上的分析物。在低离子强度下，弱结合的分析物(具有较低表面电荷密度的分子)开始从色谱柱中洗脱。随着盐浓度的增加，表面电荷密度越来越高的强结合分子依次从色谱柱中洗脱。或者，pH梯度可用于洗脱以各自pI值从色谱柱中释放的结合分析物。通过增加洗脱缓冲液的pH值来洗脱阳离子，而通过降低洗脱缓冲液的pH值来从阴离子交换柱中洗脱阴离子。如果分子在其pI值处析出，则不能使用pH梯度。

5.列再生-最后，通过洗去束缚在色谱柱上的任何分子，使色谱柱容量恢复到下一次运行。为了达到这一目的，允许高离子强度的缓冲液流过色谱柱，直到洗脱液的基线和pH稳定。然后，在下一次运行之前，用开始缓冲区对列进行调整。

尽管如此,紫外线或荧光探测器最常用于IEX，其他探测器如质谱仪，折射率(RI)或多角度光散射探测器也被使用．

根据所要分离的离子上的电荷，有两种类型的IEX色谱，即阴离子交换或阳离子交换，都被使用。阴离子交换柱上带正电荷的官能团共价连接到固定相粒子上，阳离子交换柱上带负电荷的官能团连接到固定相粒子上。顾名思义，阴离子交换色谱用于分离表面有更多羧酸基团的去质子化或“酸性”蛋白质分子等阴离子，而阳离子交换柱用于分离表面有更多氨基的质子化“碱性”蛋白质等阳离子。

离子交换柱根据其离子交换容量进一步分为强、弱阴离子和阳离子交换器。强交换剂在较宽的pH范围内保持其离子交换能力，因为它们不会随着流动相pH的变化而占用或失去质子。然而，弱交换剂在较窄的pH范围内有效，在那里它们被电离。表1显示了不同种类的IEX列及其有效pH值范围的一些示例。

表1:离子交换柱的例子。

列类型	列	官能团	pH值范围
强阴离子交换器(SAX)	季铵盐(Q)	(CH3.）3.N+CH2O-	0 - 14
弱阴离子交换器(WAX)	二乙基氨基乙基	(C2H5）2N CH2CH2O-	2 - 9
强阳离子交换器(SCX)	Sulfopropyl (SP)	哟2CH2CH2所以3.-	0 - 14
弱阳离子交换器(WCX)	羧甲基(CM)	哟2首席运营官-	2 - 9

混合模式色谱涉及两种分离机制，如RP和IEX或IEX和HIC，使用单柱来提高分析物的分辨率。

离子交换树脂的选择

IEX柱由多孔或非多孔、惰性、聚合树脂或凝胶珠填充，这些树脂或凝胶珠具有共价键合的官能团。这些基团在电离状态下将电荷传递到表面，这取决于流经色谱柱的缓冲液的pH值。这些珠子由葡聚糖、琼脂糖或纤维素等材料制成。它们具有较高的物理稳定性和均匀的尺寸，支持高流速，并确保在高pH值或盐浓度下柱体积不会变化。支撑珠的尺寸和孔隙率对电荷种类的分辨起着重要的作用。

在IEX中，选择正确的固定相是实现有效分离的关键。的固定相的选择依赖于pI和感兴趣的分析物的稳定性。如果目标分子在pH值低于其pI值时稳定，则首选阳离子交换器，但如果目标分子在pI值以上稳定，则首选阴离子交换器。如果目标分子在较宽的pH范围内稳定，则可以使用任何一种类型。

在方法开发过程中，使用强交换剂以实现广泛的pH值范围。这有助于加快这个过程。虽然在强交换剂无效时，弱交换剂的使用有助于提高分辨率，但它们有局限性，如样品负载能力随pH值的变化和较长的平衡时间。当使用IEX进行纯化时，由于目标分子和杂质上的净表面电荷不同，所选的色谱柱应保留目标分析物或杂质。介质的选择将取决于所需的净化程度，从样品捕获到最终抛光。

离子交换色谱的注意事项、优点和限制

影响分离的参数包括:

• 列-由于聚合物树脂的孔隙率和尺寸影响分辨率，必须选择合适的色谱柱以实现良好的分离。粒径越小，分辨率越高，但系统背压也越高。例如，在蛋白质纯化的早期阶段使用填充大尺寸珠子的色谱柱，而在较慢的流速下使用较小的珠子进行最终纯化。

• 缓冲区-用作阳离子交换色谱流动相的典型缓冲液包括甲酸盐(3.8)，醋酸盐(4.6)，MES(6.1)，磷酸盐(7.2)或tris(8.1)，而用作阴离子交换色谱流动相的缓冲液包括tris，哌嗪(9.7)和二乙胺(11)。pka在为IEX选择缓冲区时，应牢记值(在括号中提供)。为了保持所需的pH值，缓冲液的浓度通常应在20 - 50 mM的范围内。

• 缓冲pH值-对于阳离子交换色谱，洗脱缓冲液的pH值保持在4-7范围内，对于阴离子交换，pH值保持在7-11范围内。所选pH值必须支持目标分析物与固定相的结合，并应接近其pI值，以使其能够从色谱柱中释放。在非常低或非常高的pH值下，分析物，特别是蛋白质，可能会与固定相强烈结合，需要高盐浓度来洗脱。此外，在高pH值和高盐浓度下，一些蛋白质可能会沉淀或失去活性。启动缓冲液的pH值应分别高于或低于目标分析物的pI 0.5 - 1个pH单位，用于阴离子交换层析和阳离子交换层析。启动缓冲液的浓度必须仔细优化，以确保有效分离。正常情况下，维持色谱柱所需的启动缓冲液浓度在5 ~ 20mm范围内。

• 离子强度/盐浓度-通常用于洗脱的缓冲液含有多达300 - 500mm的盐，如氯化钠、氯化钾、溴化钠、硫酸钠或醋酸钠。

• 添加剂-如有必要，添加诸如尿素、糖或洗涤剂等添加剂以增加分析物的溶解度，防止其沉淀或通过抑制酶活性来确保分析物的稳定性。然而，添加剂可能在工作pH值时带电，并可能干扰分离。

• 样品制备-由于缓冲液的pH值决定了分子的电离状态，样品缓冲液的pH值保持在0.5 - 1.5 pH单位，高于或低于感兴趣的分析物的pI值。这确保了分子在阴离子交换或阳离子交换层析中被适当地充电。虽然缓冲液的选择取决于样品矩阵，但起始缓冲液最适合样品制备。如果使用了不同的缓冲区，则可以在分析之前与开始缓冲区交换。存在于高离子强度溶液中的样品可以在加载前用启动缓冲液稀释，只要它没有洗涤剂等污染物。粘性样品难以注入和分离;这些必须用启动缓冲液稀释。除pH值外，样品缓冲液的离子强度对获得良好的分辨率也起着重要作用。因此样品必须脱盐，并将其缓冲液交换为起始缓冲液。样品在装入色谱柱前必须经过过滤去除微粒。

• 示例加载-为获得最佳分辨率，分析物的质量不应超过色谱柱的结合能力，如制造商建议的那样。

• 梯度-运行时间和离子强度随时间的百分比变化必须进行优化，以实现所需的分辨率。通常，阶跃pH梯度优于线性pH梯度，因为后者难以精确和可重复地创建。

• 流量—在分辨率不受影响的情况下，可以使用尽可能高的流量来提高吞吐量。在色谱柱再生和重新平衡过程中可以使用更高的流速以节省时间。

虽然IEX有一些优点，但该技术也有一些局限性(表2)，在选择该技术进行生物分子的分离、纯化或定量时必须考虑到这些局限性。

表2:IEX色谱的优势和局限性。^3.

的优势	限制
高承载能力	昂贵的缓冲器和仪器
高分辨率的基团分离感兴趣的分子从其他分子和杂质	样品注入溶剂必须具有低离子强度和可控的pH值，这可能需要一个额外的缓冲交换步骤
分离的蛋白质是否只差一个带电荷的氨基酸，或者分子之间的差异很小	弱离子交换柱对pH值变化很敏感，必须在规定的范围内使用，以保持容量和分辨率
IEX可以在高流速下进行快速分离	Bio-inertLC系统可能必须用于防止高盐浓度下的腐蚀
纯化过程中目标分子的回收率较高	分离后浓缩溶液以提高蛋白质回收率会增加溶液中的盐浓度，这可能需要在进一步分析之前交换缓冲液
可用于二次分离前的预浓缩或纯化步骤。额外的优点是所使用的缓冲液不会使蛋白质变性	耦合与质谱分析(MS)由于洗脱液中的盐浓度高而受到限制

离子交换色谱的应用

在各种LC技术中用于生物制药分析IEX已广泛应用于单克隆抗体(mAbs)和蛋白质的分离纯化。阳离子交换色谱法一个盐梯度已被证明适用于分离单抗西妥昔单抗的电荷变体。⁴一种具有线性pH梯度已用于纯化一种常见的轻链igg样双特异性抗体。这种方法已被证明可以成功地分离序列上因单个带电氨基酸或pI差0.1而不同的分子。⁵代替传统的紫外或荧光探测器，amal探测器可以与IEX结合来表征蛋白质群体，如短肽、质量相似的蛋白质或SEC不能很好地分解的低聚物。⁶粗蛋白质混合物的分馏和17种蛋白质的分离已经使用线性pH梯度的阴离子交换色谱进行。⁷

提高…的安全性治疗性蛋白质和抗体， IEX用于下游净化过程中去除病毒等污染物。在单抗生产的抛光步骤中，阳离子交换色谱已被证明可以有效去除xMulV，一种模型逆转录病毒。⁸不仅是细胞，而且细胞成分也被分离出来，使用IEX进行量化或纯化。使用qc兼容的阴离子交换色谱法实现了多个血清型重组腺相关病毒(rAAV)样本中空衣壳和满衣壳的基线分离和定量。⁹用弱阳离子交换层析法纯化羊水中带负电荷的细胞外囊泡。¹⁰

除了蛋白质，糖和核酸也已使用IEX分离。聚糖已根据其唾液酸含量使用弱阴离子交换器进行分馏，然后进行脱乙酰化，纳米lc分离和MS和纳米荧光检测器检测。¹¹短RNA低聚物(~20 mers)已使用混合模式色谱分析，涉及两种分离机制，离子对RP和阴离子交换在单柱。¹²

结论

IEX是一种离子色谱，是一种多功能的纯化、表征和分析大生物分子，如蛋白质、抗体或核酸的技术。由于分离是基于这些复杂分子上的净表面电荷，IEX是其他技术如反相色谱、疏水相互作用色谱或尺寸排除色谱的重要替代方案。

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