结构生物学的关键技术，它们的优势和局限性

结构生物学是一个科学领域，使用各种技术来确定生物分子的3D结构，如蛋白质，核酸及其复合物。这些技术允许研究人员以不同的分辨率阐明分子结构，从原子到超分子水平。此外，结构生物学侧重于研究生物分子的相互作用和动力学，即分子如何随时间相互作用和变化。这对于理解生物分子的功能及其在健康和疾病中的作用至关重要。

结构生物学的主要技术包括x射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学和低温电子显微镜(cro - em)，这些技术通常与交联质谱(XL-MS)、小角度x射线散射(SAXS)、中子衍射、蛋白质水解、圆二色(CD)和电子顺磁共振波谱(EPR)等方法互补。计算方法和技术的进步也在结构生物学中发挥了重要作用，为分析、解释和整合来自不同技术的数据提供了新的方法。这使研究人员能够更深入地了解生物分子及其相互作用、动力学和与生物过程的关系。让我们来考虑这些关键技术，它们在结构生物学中的作用以及它们的优点和局限性。

低温电镜是一种电子显微镜在分析之前对样品进行低温处理的技术。一般来说，它被应用于蛋白质的结构研究，特别是那些不能用其他技术研究的蛋白质，如大的蛋白质复合物，膜蛋白或不形成晶体的蛋白质。由于电子束通过样品的相互作用，该技术可以以接近原子的分辨率(与x射线晶体学或核磁共振光谱学相当)获得图像。低温处理有利于保存样品的原始分子结构。借助于仪器和软件的最新发展，可以自动处理样品(例如蛋白质)的大量图像，并以接近原子的分辨率重建其3D结构(图1)。^{1，2，3.，4}

低温电镜的局限性在于，样品制备过程非常艰苦，一些蛋白质复合物会在制备过程中被破坏。Cryo-EM仪器及其维护是昂贵的，产生的大量数据需要大量的计算工作来处理。最后，可以使用冷冻电镜分析的蛋白质的大小有限制，因为在一定大小以下，所获得的图像显示非常低的信噪比。^{1，2，3.，4}

图1: 蛋白质结构冷冻电镜分析的工作流程。资料来源:科技网188金宝搏备用络。

这种技术是基于事实的晶体样品能够引起入射x射线束的衍射，产生一种特征图案，可以用来推断原子水平上晶体的结构。结晶样品用x射线束以不同的入射角度照射。由样品有序原子结构引起的x射线散射产生了由传感器记录的特征模式。通过信息学处理，在不同入射角获得的整套模式可以推断样品的电子密度，由此可以建立原子尺度的结构模型(图2)。^{5，6，7，8，9}

x射线晶体学是分辨率最高的结构生物学技术之一。与其他结构生物学方法相比，它具有高度自动化和相对便宜的优点。数据采集后结构解析处理速度较快。理论上，可以用x射线晶体学分析的分子没有尺寸限制，但样品结晶的容易程度存在限制。大而复杂的分子通常很难结晶，特别是当它们包含动态区域时，例如柔性区域或附着的碳水化合物。即使有可能生成复杂分子的晶体，有时也很难以良好的分辨率阐明它们的结构。最后，结晶过程会以某种方式影响分子结构，这意味着最终阐明的结构可能与生理条件下发现的原始结构完全不同。^{5，6，7，8，9，10}

图2: x射线晶体学测定蛋白质结构的步骤。资料来源:科技网188金宝搏备用络。

由于x射线辐射是高能量的，在x射线晶体学中使用的样品晶体必须在测量之前用液氮快速冷冻，以最大限度地减少样品损伤并减少热运动产生的噪声。在过去的十年中，x射线晶体学的一种变体被开发出来——串行飞秒晶体学(SFX)——它否定了这种需要。SFX是基于x射线辐射源的使用，称为x射线自由电子激光器(XFEL)，它能够产生持续时间非常短的强烈x射线脉冲(fs = 10)^-15年s).这些脉冲是如此强大，以至于它们完全破坏了样品晶体。因此，有必要对数量非常高的随机取向晶体(> 10万)进行连续分析，以阐明样品的分子结构。为了达到这一目的，将含有样品小晶体的液体喷射注入一个腔室，并由XFEL照射。由于脉冲速度极快，可以在很短的时间内分析数千个晶体(图3)。这种方法的优点是晶体比传统x射线晶体学中使用的晶体要小得多，并且在测量之前不需要快速冷冻，因此可以在室温下进行实验。此外，SFX还能提供分子动力学方面的信息。^{11，12，13，14，15}

图3: 用于蛋白质结构测定的SFX实验装置。 资料来源:Liu&Lee, 2019年， ¹⁶ 转载于 国际知识共享4.0 (CC BY 4.0)许可 ．电子源标签已与文章描述更新清晰。

在药物发现的背景下，蛋白质是新型候选药物的主要靶点。因此，阐明越来越多蛋白质的结构已成为结构生物学领域的主要兴趣。从蛋白质样品中快速获得晶体的方法的进步导致了所谓的高通量(HT)晶体学的发展。这种方法基于自动化系统、小型化和工艺集成的使用，以获得大量可在短时间内分析的结晶样品，以非常有效的方式生成大量数据集。该技术不仅可以快速优化结晶条件，而且还有助于对靶向蛋白质的候选药物进行大规模筛选。^{17，18，19，20.，21，22}

核磁共振光谱学利用一种物理现象，其中原子核被射频照射并达到激发态。当原子核恢复其基本能量状态时，会发出辐射，并被探测器收集到(图4)。探测到辐射的频率取决于原子核的化学环境，其强度与同类原子核的数量有关。有多种类型的核磁共振实验，提供关于不同化学元素的信息(例如，¹H,²H,¹³C和¹⁵N)，即它们的连通性或空间邻近性。²³

核磁共振波谱所提供的信息可以用于许多目的，包括:

• 大分子的结构说明
• 大分子动力学研究
• 生物分子间相互作用机制的表征

对于结构说明，通过核磁共振光谱获得的数据允许原子之间的距离和键角计算。这些距离和角度值被用作约束来执行结构的计算计算。在分子动力学的情况下，一些核磁共振实验被用来分析结构柔韧性和估计弛豫参数。最后，有许多实验核磁共振方法来检测分子之间的相互作用并识别所涉及的原子，这使得理解相互作用机制成为可能，这在药物发现领域非常相关。^{23，24，25，26，27}

核磁共振波谱在接近天然条件下的生物分子研究中特别有用，因为它通常在水溶液中进行。这是一种非常通用的，非破坏性的技术，由于大量不同的实验可用于分析不同的分子方面。核磁共振波谱与低温电子显微镜和x射线晶体学一起，是生物分子结构测定最常用的方法之一。^{24，25，26，27}

然而，核磁共振波谱有其局限性。首先，仪器和维护相当昂贵。其次，它的灵敏度很低，因为大多数可以分析的原子核对应的同位素自然发生率很低。这意味着许多生物分子样本必须在某些同位素(如¹³C或¹⁵N)，这是一个昂贵的过程。此外，溶液核磁共振光谱分析的分子大小也有限制，因为大分子会影响样品在水溶液中的均匀性，这是一个临界点。在这些情况下，固态核磁共振波谱可以是一种替代方案。^{23，24，25，26，27}

图4: 蛋白质结构测定的核磁共振波谱工作流程。资料来源:科技网188金宝搏备用络。

XL-MS是一种质谱分析(质谱)用交联剂处理生物样品(分离的蛋白质、大分子复合物、细胞器、细胞甚至组织或器官)的分析。然后，样品进行酶促蛋白水解，随后用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)．^{28，29，30.，31， ，32，33，34}

用交联剂处理会在样品中相互作用的蛋白质或其他分子的不同区域之间产生许多附着。当样品进行蛋白水解时，样品中的蛋白质会裂解，但交联区域会保持附着。由于交联的长度是已知的，对结果数据的计算分析将建立蛋白质之间的距离限制，并确定哪些蛋白质相互作用。把所有这些数据放在一起，就可以描述样本中存在的蛋白质相互作用网络(图5)。^{28，29，30.，31，32，33，34}

XL-MS是一种高灵敏度的技术，能够检测和识别非常少量的分析物(~10^-15年摩尔)。与其他技术相反，所研究分子的大小或复杂性没有限制，因为质谱分析是在蛋白质片段上进行的。由于交联反应可以在生理条件下进行，结果将反映自然条件。这项技术的主要贡献是它能够生成关于蛋白质相互作用网络的高通量信息，特别是在具有挑战性的系统中，如内在无序蛋白(IDPs)。^{28日,29，30.，31，32，33，34}

在这种技术中，确保获得高质量的质谱数据以减少交联物种分配中的歧义是非常重要的。仅仅使用XL-MS是不可能完全阐明分离的蛋白质或蛋白质复合物的，有必要使用补充技术，如冷冻电镜。^{28，29，30.，31，32，33，34}

图5: 一个典型交联质谱(XL-MS)实验的总体方案。资料来源:Tec188金宝搏备用hnology Networks，改编自Low等人，2021年。 ³⁵

SAXS是一种基于x射线光子与样品相互作用后的弹性散射技术，并收集相对于原始光束轨迹的小角度(通常为0.1-10°)的辐射。^{36，37，38，39，40}

在典型的SAXS实验中，样品被x射线照射，以低角度散射的辐射被记录并表示为衰减强度曲线。对这条曲线进行数学分析，可以估计与分子的大小和形状有关的参数。使用ab在开头SAXS数据的计算建模，可以建立低分辨率分子模型，这对于确定大分子的整体形状或蛋白质结构域的一般分布非常有用(图6)。在这方面，这些模型可以与其他技术(如x射线晶体学和核磁共振波谱学)求解的蛋白质结构域的高分辨率结构相结合，以获得分子结构的更详细描述。^{36，37，38，39，40}

SAXS是研究低分辨率非结晶生物分子结构的有用工具。用这种技术可以分析范围广泛的分子大小(从kDa到GDa)和条件(从原生到极端)。此外，SAXS能够提供分子过程的动力学和动力学信息。SAXS需要少量样品，在测量过程中一般不被破坏，可制备为液体、溶液或粉末。^{36，37，38，39，40}

SAXS的主要局限性是与其他技术相比，其分辨率较低，特别是在溶液或部分有序样品中。为了获得分辨率，必须使用强大的x射线源，例如同步加速器，由于成本和尺寸的原因，只有在大型研究机构中才能使用。由于蛋白质是不稳定的分子，在测量过程中可能会发生一些损伤。^{36，37，38，39，40}

图6: SAXS实验的实验方案，以获得蛋白质样品的结构信息。资料来源:科技网188金宝搏备用络。

中子衍射技术是基于中子束以不同的入射角度照射样品。中子与样品分子的相互作用导致了它们的散射，产生了一种依赖于原子水平上样品结构的特征模式(图7)。在这个意义上，基本原理与x射线衍射技术相当相似，但主要区别是与x射线相比，中子的穿透能力更高。因此，无论样品的厚度如何，都可以获得样品体积的信息。中子能够与原子核相互作用，而不像x射线那样与周围的电子云相互作用。因此，中子衍射对同位素差异很敏感。^{6，41，42，43，44，45}

中子衍射分析的样品必须是结晶粉末的形式，但如果孤立晶体足够大(比x射线晶体学所要求的大)，也可以使用孤立晶体。与x射线晶体学类似，通过分析该技术获得的散射图来提取分子的结构数据(图7)。然而，中子衍射相对于x射线衍射的优点之一是它能够提供氢原子的信息。这些原子在x射线辐射下几乎看不见，因为它们的电子密度非常低。相反，中子衍射能够提供样品中氢键和水分子方向的信息。此外，该技术具有较高的空间和时间分辨率，可用于分子动态特性的研究。^{6，41，42，43，44，45}

与x射线衍射相比，中子衍射技术具有一些优势，例如它能够提供涉及轻原子(如氢)的结构信息，以及它区分不同同位素的能力。然而，这种技术存在一些重要的缺点。首先，中子源的建造和维护非常昂贵。其次，对于单晶分析，样品必须比x射线晶体学中使用的样品大得多。最后，这种技术可能需要很长的实验时间来获得获得高分辨率结构信息所需的数据。^{6，41，42，43，44，45}

图7: A)一个典型的中子衍射实验方案和得到的光谱。B)中子衍射谱拟合与所分析分子的形态和结构因素有关。来源:Castellanos et al.， 2017， ⁴⁶ 转载于 国际知识共享4.0 (CC BY 4.0)许可 ．

解决蛋白质结构和形状的一个有用的方法是在分析之前对蛋白质样品进行有限的蛋白质水解。蛋白质水解是由于氨基酸之间肽键的水解，蛋白质被酶分解成更小的肽的过程。然而，处于天然状态的蛋白质对蛋白质水解有相当的抵抗力，在许多情况下，在这个过程中只有一个肽键断裂。这一现象的原因是蛋白酶只能在具有一定灵活性的蛋白质区域(如环)上发挥作用，因此活性有限。这可以解释为发生在位于二级结构元件内的肽键上的蛋白质水解将需要先前失去大量稳定相互作用，使该过程在能量上不利。^{47，48，49，50，51}

有许多蛋白酶可用于进行蛋白水解，它们通常具有氨基酸特异性。在有限的蛋白质水解后，可以通过其他技术(例如，LC-MS)分离、分析和鉴定所得到的肽(图8)。在这种情况下，蛋白质水解方法可用于识别蛋白质中的柔性区域和结构域，通过生成折叠中间产物，然后对其进行有限的蛋白质水解来研究蛋白质折叠，并表征蛋白质聚集过程。^{47，48，49，50，51}

有限蛋白水解与其他技术相比具有适用于溶液中的样品的优势，即在原生条件下。此外，与其他物理化学技术相比，它是一种更简单、更便宜的方法，不需要任何特殊的仪器或大量的样品。然而，有限的蛋白质水解不是一种高分辨率的技术，有必要补充它的分离和分析程序涉及更敏感的技术，如LC-MS。^{47，48，49，50，51}

图8: 使用有限的蛋白质水解方法研究蛋白质-药物相互作用的实验流程。资料来源:Tec188金宝搏备用hnology Networks，改编自Holfeld等人，2023年。 ⁵²

CD光谱学是一种基于圆偏振光与物质相互作用的技术。电磁辐射是由垂直于磁场振荡的电场构成的xy飞机)。包含这两个场的平面又垂直于波传播的方向(z轴)。当辐射被极化时，它的电场以特定的几何方向振荡。在圆极化的情况下，辐射的电场以描述圆周的恒定速率旋转。这种旋转可以是顺时针(右圆偏振光，RCP)或逆时针(左圆偏振光，LCP)。圆偏振辐射能够与光学活性分子(手性分子)相互作用;这些分子包含一个或多个原子，并与四个不同的取代基结合。^{53，54，55，56，57}

在典型的CD光谱学实验中，样品用不同波长的圆偏振光照射，通常从紫外线到可见光范围。由于蛋白质是具有光学活性的分子，它们能够吸收部分辐射。RCP和LCP被样品吸收的不同，这种差异(Δε)被称为“圆二色性”(图9A)。实验结果显示代表Δε作为波长的函数。所得曲线的形状可能与蛋白质的二级结构有关(图9B)，在某些情况下，可以获得样品中某些二级结构元素含量的定量估计。^{53，54，55，56，57}

CD光谱学是一种简单且相对便宜的技术，可以获得关于蛋白质和多肽的二级结构和折叠/展开的信息。CD实验很容易进行，不太耗时。蛋白质和多肽可以在自然条件下进行研究，因为测量是在溶液中进行的，只需要低浓度的分析物(~μM)。^{53，54，55，56，57}

这种技术的一些局限性包括一些化学物质可能会干扰测量(吸收相同波长的物质，如许多缓冲液和氯化物)。复杂分子的详细结构信息难以推导，二级结构元素的定量只有在分析小肽时才可靠。^{53，54，55，56，57}

图9: A)圆形二色实验方案，说明CD光谱仪的所有元素。B)蛋白质中二级结构不同元素的典型CD光谱例子。图源:Pignataro et al.， 2020， ⁵⁸ 转载于 国际知识共享4.0 (CC BY 4.0)许可 ．

EPR光谱是基于微波辐射和未配对电子的电子自旋之间的相互作用。其工作原理与NMR光谱学非常相似:将样品置于外部磁场中，然后用微波辐射(NMR中的射频)照射，被未配对电子(NMR中的原子核)吸收，达到激发态。当未配对电子恢复其基本能态时，样品发出辐射，经检测和处理后产生EPR谱，从中可以推断出各种类型的结构信息(图10)。^{59，60，61，62，63，64}

生物分子通常不是顺磁性的，这意味着它们不包含未配对的电子(顺磁性分子，如自由基，非常不稳定)。因此，在EPR分析之前，有必要将其转化为顺磁分子。最常见的方法是使用自旋标记方法，即将非活性顺磁性化学基团(通常是含氮基团)附着在生物分子上。在蛋白质中，位点定向自旋标记(SDSL)用于在特定氨基酸中引入未配对电子。EPR可用于研究生物分子的许多方面，如分子运动和动力学，以及不同二级结构元素的存在。通过这种技术，也有可能获得分子内顺磁中心之间距离的测量。这些距离可以作为建立分子模型的约束条件。^{59，60，61，62，63，64}

EPR光谱具有较高的空间(nm)和时间(ps -μs)灵敏度，这对于研究蛋白质动力学，特别是高动态蛋白质(如IDPs)非常有用。尽管在分析的分子中使用自旋标签是必要的，但它们的小尺寸在系统中产生了最小的扰动。所分析的分子没有大小限制，光谱比其他技术更简单，因为只有未成对的电子可见。该技术提供了相关的结构信息，但需要与其他高分辨率技术相辅相成，才能得到被分析生物分子的完整结构模型。此外，自旋电子与附近的核自旋耦合导致信号分裂和展宽，这降低了分辨率。^{59，60，61，62，63，64}

图10: A)典型EPR光谱仪方案。B)来自一个实验的EPR光谱，该实验旨在研究蛋白质在存在和不存在蛋白质激活剂时的折叠。这些光谱反映了蛋白质折叠在原生和错误折叠状态之间的变化，以及在正确折叠的蛋白质中活性和非活性形式之间的变化。图片来源:Tec188金宝搏备用hnology Networks，改编自Balo等人，2019年。 ⁶⁵

要了解更多关于结构生物学的知识，它能告诉我们什么以及它的应用，请访问下面的文章。

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