如何改变CRISPR大规模筛选吗

CRISPR库为大规模筛选提供巨大的优势,包括前所未有的编辑效率、精度和速度。本文走过的基本面CRISPR筛查和最令人激动的应用程序,包括要理清细胞信号网络,发现病毒像COVID-19感染细胞和发现新的药物靶点。

高通量DNA测序的出现给了我们更多的信息比以往的基因组成的生活。然而,测序数据的使用没有互补了解序列生成的函数。

Genotype-phenotype研究,涉及改变特定基因的表达,研究影响细胞或生物体,使我们理解特定基因的功能,最终整个基因组。这种方法是相当重要的遗传学的历史,导致重要的见解通过一系列的发育和功能的物种,包括我们自己。

早期genotype-phenotype筛查方法应用技术,如定点诱变、同源重组和反义RNA——导致失去功能或改变基因表达。但这些是受到限制,包括复杂的协议,错误率高。

最近,核糖核酸干扰(RNAi)接任击倒基因在全基因组范围内的最佳方式,干扰RNA (siRNA)成为一个较短的领先技术大规模表型屏幕。然而,这仍然可以只实现部分抑制基因活性和高速率的脱靶效应。

进入CRISPR筛选

CRISPR / Cas9的发展曾获诺贝尔奖基因编辑系统,改变了这一切。CRISPR / Cas9筛选高效和精确,没有瘟疫RNAi屏幕的脱靶效应。CRISPR是完全可编程,针对一个特定的DNA序列通过使用一个指导RNA (sgRNA)。

CRISPR精确目标的能力的大规模基因组序列是否删除,添加或改变DNA序列——快速全基因组屏幕看到它成为占主导地位的制度。

除了CRISPR淘汰赛库、目标基因的整个基因组功能完全丧失,还有两个变化这一主题:CRISPR-a(激活)和CRISPR-i(抑制)库,可用于调优目标基因的表达向上或向下控制方式不改变底层蛋白质编码DNA序列。

使转染细胞池不同的sgRNAs可以改变成千上万的基因在一个实验在整个基因组已成为一种流行的方式,研究人员研究生物过程的遗传基础。

虽然可以创建自定义sgRNA库在个案基础上,在实践中这是一个耗时和昂贵的过程。出于这个原因,一些公司现在提供现成的CRISPR大规模筛选库。

Multi-guide RNA库

典型CRISPR屏幕旨在通过削减一个基因敲除基因在特定的地方在一个编码区然后完全修复细胞的异源端加入(NHEJ)系统。这导致的损失或增加一小部分DNA,产生基因转移,停止工作。

虽然这种技术通常是有效的,所产生的变化有时会没有影响基因功能,添加一层不可预测性和不确定性到屏幕上。Synthego总部位于加州的公司提供授权的CRISPR筛选库人基因组学通过使用multi-guide,克服这个问题策略。

”,使一个基因敲除在任何给定基因,常常需要多个屏幕指南rna并确定不仅活跃但也可以生成一个转移。这是一个耗时的运动和能阻碍设计努力生成高通量,排列基因敲除库,“Synthego科学主管凯文·霍尔顿解释道。

Synthego的战略雇佣了三个独立的sgRNAs旨在共同努力,确保高减少活动。这种multi-guide方法生成一个片段缺失的一个外显子,一致结果的基因敲除,提供一个新的水平的再现性和一致性。

”multi-guide方法可以节省人员大量的时间通过移除评价,猜测和担心使用个人sgRNAs敲除基因有关,”霍顿说。

CRISPR筛查的最新进展

大规模筛选领域的快速发展,近年来几个创新将发挥作用。

目前,全基因组CRISPR屏幕开始利用合用指南几个基因,需要多次进一步筛选积极打击目标基因。液体处理技术的进步将从池CRISPR库排列库中的每个好sgRNAs microtitre板包含一组的设计为单个基因敲除或调节,这将大大简化的任务目标反褶积。

另一个发展是表型选择屏幕。这涉及到感染细胞的大量与lentiviral-encoded CRISPR库,然后让他们选择挑战,如病毒感染或耐药性。任何存活的细胞可以通过高通量测序分析来识别引导序列存在于人口和揭示了基因。

也有介绍小说CRISPR-based基因微扰的方法移动,新车型,如3 d瀑样和集成与其他技术如单细胞RNA序列。霍尔顿预计扩大的基因组区域的目标这些库。

“我认为这是很有可能我们会看到CRISPR筛选库开始目标基因组的其他有趣的领域,不仅仅是编码区域,包括启动子或增强子区域库,内含子库等等。”

推动未来的药物发现和开发

快速部署的高通量CRISPR筛查方法是药物开发管道改造。

在发现阶段目标,CRISPR库可以用来摧毁大数组的单个基因在细胞和识别表型变化。一个常见的应用是在合成杀伤力化验,旨在识别新药物杀死癌细胞相互作用突变。

CRISPR筛查也可以部署在早期阶段的研究,包括理解疾病的机制。CRISPR筛查已经基本理解的信号癌症细胞例如,帮助识别的一些癌症发展的关键因素。

CRISPR筛查的另一个主要应用是了解病毒感染宿主细胞。COVID-19大流行期间,CRISPR筛查有助于识别SARS-CoV-2进入人体细胞所需的关键蛋白质和识别几个蛋白,可以发展成小说COVID-19疗法。

通过非典CRISPR屏幕网站,研究人员可以浏览的结果SARS-CoV-2 CRISPR屏幕,看看他们的质量控制措施,甚至比较多个实验的结果——一个有力的例证研究团体一起利用CRISPR筛查全球健康的好处。

作为大规模高通量CRISPR筛查工具继续发展步伐,这种强大的技术的应用是有限的,只有研究人员的想象力寻找下一代的目标和治疗。

关于作者:

埃里克·罗兹的首席执行官人基因组学。