脂质在mRNA杂质:影响和解决方案
拯救生命的治疗和疫苗的发现和大规模生产更复杂的比最初的合成。一种化合物可以面对各种并发症在整个开发和制造阶段,如杂质与传统分析方法难以检测。最近发现杂质mRNA-based产品也许是理想的例子。
许多制药公司依赖于脂质纳米粒(lnp) mRNA的疫苗的淋巴结负责生产白细胞的免疫反应。lnp的航空公司由于他们的主要选择生物相容性的自然,易于扩大和化学性质,提高细胞吸收。此外,研究现况的属性已经帮助建立基于基因治疗的理想载体。
尽管有前途的性质,风险LNP使用浮出水面最近的一项研究由现代化,一个特定的基于脂质成分的活性杂质共价结合的信使rna,显著改变信使rna的功能。此外,传统的分析未能检测到有关修改。
最近的一次采访中,亚当·克洛博士分析开发经理在精密纳米系统公司,揭示了为什么这个新发现的杂质是有害的信使rna功能以及如何更准确地检测到。
得脂质氧化作为一种有害的mRNA杂质来源
Kerstin波尔(KP):你会如何描述这个新类的mRNA杂质?
亚当·克罗(AC):我们正在谈论的杂质是第一位的
造成的脂质加合物很可能氧化叔胺N-oxide物种,它分解形成醛非常被动的信使rna。Basicslly,这种加合物是脂质共价连接到mRNA。
KP:你如何期待这个mRNA杂质mRNA-LNP开发人员成为一个问题?
交流:客户寻求纳米粒子根据其特定的研究主题,所以也有很多得脂质物种发生显著的变化在易受氧化。此外,某些类型的氧化与mRNA容易形成加合物,而另一些则不是。您需要能够识别不仅存在,而且在脂质氧化的类型解释损坏的程度可以做你的信使rna。
因为这些脂质加合物是相对较小的整个mRNA,相比传统的方法如毛细管凝胶电泳(CGE),该显示器mRNA的完整性,不能认出他们。在较小的寡核苷酸biotherapeutics,如核,小比例的脂质加合物还不足以影响寡核苷酸的功效。信使rna比核规模大得多,所以每mRNA分子烷基化分数的增加,即使概率是相同的。
梅瑞迪斯封隔器的研究清楚地表明,脂质氧化杂质的存在和相对丰富的105(10 ppm)足以抑制整个信使rna的功能。这个特定的信使rna杂质需要强调与尖端分析。
完整性分析与分裂
KP:CGE的方法,为什么他们用作mRNA杂质标准分析?
交流:CGE给你一个坚实的分辨率分析mRNA的完整性。通过监控规模、质量和完整性在制造业,我们确保mRNA仍然完好无损,并确定是否有制造步骤导致信使rna降解。与不断发展中CGE工具,您可以分析9000个核苷酸的RNA结构。
CGE被用作原料的分析mRNA的mRNA mRNA-LNP接合,以确保完整保留。这种方法通常是优先于反相离子对高效液相色谱法(RP-IP-HPLC),因为它是更好地解决高分子量的物种,这使得它适合mRNA完整性分析。除了早期的开发阶段,我们使用CGE质量测量,因为它是一个相对简单的和健壮的releasin化验g一批为进一步使用。
问题是,得加合物的脂类杂质的mRNA不会引起足够重量的重大差异。更具体地说,一个加合物会导致大约100 - 200 Da质量转变,而MDa mRNA在1 - 2的顺序。即使10加合物/ mRNA,整体质量转变仍不到1000整个mRNA的分子量。此外,inp可以在许多网站进行氧化,但氧化被认为是有害的,只有当它在叔胺。因此,检测氧化增加了决策的是不够的。
这个问题最好的方法是通过分裂质谱分析脂质原料,看看比例的氧化与有害N-oxide形成。然后你只能减轻mRNA的新类杂质的风险。
KP:之前的标准质谱方法用于脂质分裂?为什么不帮助在这个特定的分析?
交流:Collision-induced离解(CID)已经被裂开通常用于分析生物分子不稳定债券,如酯键。问题是派生的碎片通常不是诊断。CID无法提供全面的债券破损,需要理解氧气结合分子的不同部位,如烯烃与叔胺。CID不会给你的范围键断裂区分不同类型的氧化。
KP:核磁共振(NMR)谱也被用于分析得脂质氧化?
交流:核磁共振、样品制备和表征是非常耗时的,更不用说高成本。很多纳米颗粒制造商不使用核磁共振。更重要的是,调查中使用核磁共振检测脂质氧化没有动态范围的相对丰度大约10 ppm。
KP:你能告诉我们一些关于最新的液体色谱-光谱法(质)方法用于检测得脂质氧化比以前的方法更准确吗?
交流:我们最近与SCIEX合作,开发了ZenoTOF 7600系统作为一种高分辨率质谱分析的解决方案。ZenoTOF electron-activated离解(EAD)方法帮助我们揭开分子水平的脂质结构分析所需的细节。动态范围的增加使我们能够检测低丰度杂质,而债券破损的筒子,给了我们更好的报道,让我们确定准确的网站——链结合氧或氧化官能团的氧化。
因此,我们设法区分不同类型的脂质氧化分相对含量。
在识别脂杂质,可以执行额外的净化或修改合成工艺与N-oxides减轻风险。
利用脂质分裂结构细节
KP:你的数据结合起来CGE和质/女士的筒子,得到一个完整的把握mRNA-LNP产品在一天结束的时候吗?
交流:现况分析复杂材料。你可以有5到20个不同的化验你的材料根据指示和要求。各个方面的质量保证是没有商量余地的mRNA分析。所以,CGE还必须确认信使rna是完整和有效的,但你也需要从质谱结构细节,即含铅。您还需要确定原材料(mRNA和脂质)和他们的结合(LNP),看着pH值,同渗重摩,信使rna的5 '帽结构和聚腺苷酸化。任何一个可以生产失败点,所以目标是得到一个完整的图片的产品通过不同的数据。
KP:它会产生何种影响mRNA-LNP疗法和疫苗的未来?
交流:携带遗传物质通过lnp他们的目标是一个非常强大的技术,我认为在不久的将来将成为更广泛的采用,不仅在COVID-19研究中,而且在肿瘤学和个性化医疗。实验室已经证明了它们的功能设置。问题是,质量控制不是最关心的初步研究。一旦转化成功的大规模生产,你面临一些风险需要优化的产品组合、演示正确的脂质行为和确保你的下游工艺参数正确工作。
今天,有一个强大的趋势和需要降低所有的下游流程尽可能早。直到现在,inp合成不足会中途被发现只有制造业,罪魁祸首通常是一个活性物种,可以避免更早。这意味着一个巨大的浪费时间和资源的客户端。
技术水平对于生脂质分析,如铅,允许我们定位问题在最初几周内——如果不是天——产品的生命周期。然后,我们可以通知客户潜在风险的下游流程和纠正缺陷。这些进步的终极利益更快进入制造业和市场与更高的对产品的信心。
亚当·克洛博士是Kerstin波尔,高级全球营销经理,基因治疗和核酸,SCIEX。
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