CRISPR干扰

CRISPR干扰(CRISPRi)是一种新颖的方法击倒的特定基因。

CRISPRi系统使用一个停用Cas9核酸酶(dCas9)融合到我们的专有SALL1-SDS3目标基因的转录抑制因子构建阻止,没有切割DNA。

CRISPRi好处	理想的应用程序
CRISPR特异性- PAM-anchored瞄准系统	功能丧失,在生物学上研究基因功能相关的可拆卸的模型
温柔击倒——基因敲下来,不是	多路复用,适合多个基因同时击倒
长时间的课程——siRNA相比镇压持续时间更长	正交验证,使用并行CRISPRko和/或RNAi健壮的数据
下调基因内的本地上下文

CRISPRi系统

的Dharmacon™CRISPRmod CRISPRi系统需要两个组件:一个专门dCas9融合阻遏蛋白(SALL1和SDS3),和一个导游RNA专门设计针对该地区立即下游基因的转录起始点(TSS)。指导同事dCas9-SALL1-SDS3和指导DNA抑制因子复杂目标站点(图1)。

我们提供慢病毒和瞬态方法抑制蛋白和导游介绍。

图1所示。图的dCas9-SALL1-SDS3 sgRNA立即针对该地区下游基因的转录起始点(TSS)。CRISPRi系统需要交付两个组件感兴趣的细胞:dCas9-SALL1-SDS3蛋白质和RNA CRISPRi指南。

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3阻遏构造

CRISPRi系统,本地Cas9 DNA-cutting功能已经被点突变,和停用Cas9 (dCas9)蛋白质已经被融合进一步改造基因镇压地平线的专有SALL1和SDS3阻遏域。

之前我们测试很多阻遏构造创建dCas9-SALL1-SDS3融合。虽然许多当前CRISPRi系统依靠dCas9-KRAB变体(吉尔伯特et al ., 2013年,杨et al ., 2018年,Moghadam et al ., 2020年,Alerasool et al ., 2020),我们的小说阻遏,共价链接到dCas9蛋白,进一步抑制靶基因转录招聘蛋白质参与染色质重塑和基因沉默(Alland et al . 2002年)。结果是一个广泛的功能抑制因子,关闭基因表达下降但不是(图2)。

我们也比较了特异性dCas9-SALL1-SDS3 dCas9-KRAB使用全RNA转录组测序(RNA-seq)和观测一致的趋势在目标基因:虽然阻遏蛋白都同样非常具体,dCas9-SALL1-SDS3调节目标基因镇压更有效(图3)。我们相信我们阻遏系统为研究人员提供了更多不同的实验结果不引入额外的噪音或不确定性。

RNA CRISPRi指南

所有CRISPRmod指导rna算法优化的特异性和最大化性能,可用于合成和慢病毒包装格式。

CRISPRi需要指导RNA设计目标区域0 - 300碱基对的下游目标基因的转录起始点(TSS)导致干涉。设计功能指南rna可能是一个挑战,因为tss并不总是好的注释或无法访问其他蛋白质的因素。地平线的CRISPRi指南RNA产品使用一个发表CRISPRi v2.1通过机器学习算法开发技术(m . a . Horlbeck et al ., 2016)。算法使用阴影和运用数据库预测tss和结合染色质,位置和序列数据来预测RNA设计高效的指南。挑战基因替代tss、指导,rna提供目标各自的tss。地平线上列出了三个指南RNA设计/ TSS,排名的顺序预测功能。

CRISPRi合成sgRNA

我们很自豪能成为第一个提供CRISPRi合成single-guide RNA (sgRNA)。这种格式使co-transfection或电穿孔CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3信使rna或引入稳定dCas9-SALL1-SDS3表达细胞,并提供最快的方法获取CRISPRi结果。使用此方法,基因转染24小时后压迫明显和持续96小时(图4)。

CRISPRi基因镇压post-transfection观察24小时,最大post-transfection 48 - 72小时

图4。CRISPRi合成sgRNAs达到最大镇压在48 - 72小时post-transfection dCas9-KRAB和dCas9-SALL1-SDS3-expressing细胞。U2OS细胞稳定表达集成dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SDS3镀在10000细胞/并使用DharmaFECT转染4转染试剂的池预先设计合成sgRNA(25海里)针对CBX1, HBP1或SEL1L。细胞收获在24、48、72、96、120和144小时post-transfection,总RNA是孤立的,并使用RT-qPCR相对基因表达测定。计算每个目标基因的相对表达与∆∆Cq方法使用GAPDH作为看家基因和规范化的新控制(NTC)。

池合成sgRNA CRISPRi效率增加

汇集sgRNAs产生基因击倒最功能相当于或大于个体指导RNA(图5)。

池是一个非常好的战略驱动最大基因镇压,也有利于减少一个实验的规模,例如,当执行一个分析的多种基因排列板格式。

池sgRNAs增强基因击倒

图5。独立个体CRISPRi sgRNAs实现健壮的目标基因镇压,但汇聚在一起在一个单一的试剂时,显示增强的镇压的水平。U2OS细胞稳定表达综合dCas9-SALL1-SDS3镀在10000细胞/并使用DharmaFECT转染4与CRISPRi转染试剂合成sgRNA针对BRCA1, PSMD7, SEL1L或ST3GAL4。CRISPRi sgRNAs单独或混合使用(总共25 nM)的浓度。post-transfection细胞收获72个小时,总RNA是孤立的,并使用RT-qPCR相对基因表达测定。每个基因的相对表达计算与∆∆Cq方法使用GAPDH作为看家基因和规范化的新控制(NTC)。

多路复用基因击倒

CRISPRi合成sgRNA提供了一个独特的方法,同时可拆卸的多种基因(图6)。每个指导RNA结合其特定的DNA目标独立和依赖于体内提供dCas9融合蛋白,从而最小化任何内源性通路竞争。我们的科学家们在iPSC细胞中多路CRISPRi的有效性进行验证。

合成sgRNAs使简单的多路复用多个基因同时镇压的

图6。个人CRISPRi sgRNAs可以汇集在一起,一个试剂达到增强目标基因镇压或多路复用支持同时多个基因的镇压。WTC-11人类“诱导多能性”细胞稳定表达综合dCas9-SALL1-SDS3与CRISPRi nucleofected合成sgRNA瞄准PPIB SEL1L, RAB11A通过Lonza 96 -航天飞机系统。最活跃的CRISPRi sgRNA为每个基因的目标选择和使用单独或作为多目标的一部分,池的浓度3µM /指南。post-nucleofection细胞收获72个小时,总RNA是孤立的,并使用RT-qPCR相对基因表达测定。为每个目标基因的相对表达计算与∆∆Cq方法使用ACTB作为看家基因和规范化的新控制(NTC)。三个基因同时压抑没有实质性的减少目标基因镇压或标记细胞生存能力和形态的变化。

确认基因镇压

有许多方法来证实基因镇压,包括RT-qPCR,西方的屁股,或免疫荧光分析。通常情况下,最快的和简单的方法来测量目标的相对变化的基因表达水平之间的样品处理的新控制和rna是RT-qPCR CRISPRi指南。RT-qPCR分析与SYBR绿色方法或probe-based基因表达分析。执行RT-qPCR时要注意的一件事是基因表达水平可能会下降的水平CRISPRi治疗后无法察觉。在这种情况下,当使用∆∆Cq方法的分析,一个任意值代表qPCR仪器的检出限是用作保持者“non-detectable”作为一个非零值执行计算是必要的。在大多数情况下,这个值将在35到40之间,这取决于程序的循环次数和仪器Cq测定方法。许多协议建议添加额外的周期(45)标准qPCR循环条件。

在我们的实验室中,基因水平的可拆卸的已被证明不相关与基底的目标每个基因表达水平(图7)。例如,基因PPIB属于peptidyl-prolyl顺反异构酶(PPIase)的家庭。PPIB是许多细胞类型中高度表达,是基因,我们建议的积极控制。在这里,我们显示相对广泛的基因的基因击倒。有趣的是,我们看到类似的基因转录镇压在基础表达水平高或低。

CRISPRi并不依赖于内源性表达水平

图7。CRISPRi转录镇压由基因各不相同,但似乎并不依赖于内源性表达水平。数据来自多个转染的编译执行U2OS细胞稳定表达整合dCas9-SALL1-SDS3以下匹配条件。细胞被镀在10000个细胞/并使用DharmaFECT转染4转染试剂与CRISPRi合成sgRNA池(25海里)针对21个基因与不同的基底的表达水平。post-transfection细胞收获72个小时,总RNA是孤立的,并使用RT-qPCR相对基因表达测定。计算每个目标基因的相对表达与∆∆Cq方法使用GAPDH作为看家基因和规范化的新控制(NTC)。CRISPRi-mediated目标基因镇压左边图所示的基因是下令从低到高水平的基础转录表达。正确的目标基因表达图绘制与每千碱基片段记录每百万(FPKM),基底的表示基因表达基于RNA-Seq数据从父母U2OS细胞线。U2OS细胞PPIB表达在基础层面上大约一倍大于SOX2,但两个基因可以抑制百分比大约20 - 25的基底表达式CRISPRmod CRISPRi试剂。

正交验证

科学是良好的科学验证。Dharmacon试剂包括范围广泛的试剂,审问细胞通路,使失活的基因在DNA水平,调节RNA转录,或有辱人格的成熟的mRNA转录。我们是来帮助你选择最好的方法为应用程序基因激活或失活。更好的是,选择两种方法对健壮的、优雅,科学验证。

CRISPRi RNAi后的后续研究提供了理想的机会或者CRISPRko筛查(图8)。在这里我们使用CRISPRi跟进一个排列siRNA屏幕我们之前进行的。

合成CRISPRi试剂可以用于二维验证从siRNA屏幕上

图8。损伤反应试验。h4AX(核心组蛋白复合物的组成)周围的双链断裂迅速磷酸化,产生一系列的反应通过DNA损伤信号网络。廉价的蛋白质的DNA损伤的关键途径导致未修理的双链DNA断裂的积累,和增加磷酸化h4AX(γ-h4AX)。点击从之前的RNAi屏幕垂直的验证使用CRISPRi试剂。U2OS细胞持续表达dCas9-SALL1-SDS3 hEF1α下启动子与汇集转染sgRNAs (50 nm)或ON-TARGETplus SMARTpools (50 nm)针对RPA2, RPA1,或使用DharmaFECT RRM2 post-transfection 4转染试剂。72小时,细胞被固定和染色anti-phospho-h4AX抗体,和赫斯特污点被用来识别核。重复的板是收获,总RNA是孤立的,并使用RT-qPCR相对基因表达测定。为每个目标基因的相对表达计算与∆∆Cq方法使用GAPDH作为看家基因和规范化的新控制(NTC)。

CRISPRi实验注意事项

有许多选项和注意事项CRISPRi实验条件。一般来说,用户实现最健壮的击倒在处理一个稳定的人口dCas9-SALL1-SDS3细胞。为扩展的计算分析(超过120小时),许多选择慢病毒sgRNA。短期化验(小于120小时),合成sgRNA给更健壮的比表示指导rna基因镇压。

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3源	指导RNA格式	交货方法	好处&推荐使用
CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3慢病毒颗粒 转导&选择CRISPRi dCas9稳定细胞	CRISPRi合成sgRNA	转染或电穿孔	短期内化验 池指导rna增加压制目标基因的功能 多路同时击倒目标基因通路或内部网络 排列的筛选
	CRISPRi慢病毒sgRNA粒子	转导	稳定的表达式扩展的计算分析 低莫伊-单一集成稳定甚至镇压
CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNA	CRISPRi合成sgRNA	Co-transfection或电穿孔	短的计算分析,结果在数小时内 慢病毒免费的工作流 浓缩的细胞表达EGFP和嘌呤霉素抵抗选项dCas9-SALL1-SDS3机械 池指导rna增加目标基因的镇压 多路同时击倒目标基因通路或内部网络 适合工作的主要细胞

CRISPRi工作流

我们提供多个工作流选项时使用CRISPRi转录镇压

• 转导与dCas9-SALL1-SDS3慢病毒颗粒生成CRISPRi-ready稳定dCas9-SALL1-SDS3表达细胞。然后介绍了)合成或(B)慢病毒sgRNA击倒你的目标基因。这个系统是理想的筛选、延长时间点化验或处理difficult-to-transfect细胞类型。
• C) Co-transfect或electroporatedCas9-SALL1-SDS3 mRNA与合成sgRNA,然后用荧光丰富细胞群或嘌呤霉素耐药性的选择。这个系统是最适合快速瞬态基因镇压的研究。

引用

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