表观遗传调控基因组DNA的基因表达是很重要的在细胞分化和发展的有机体。表观遗传学也导致人类疾病。在分子水平,表观遗传学涉及修改构成染色质的组蛋白蛋白质和DNA。蛋白质的家庭已确定调解这些修改,和描述特定的绑定交互非常重要定义相互作用的特异性和亲和力。这个特征也很重要在发展中药物抑制这些chromatin-binding蛋白质。本白皮书总结了等温滴定如何量热法(ITC)是用来描述的蛋白质参与表观遗传调控。
表观遗传学是研究遗传因素所导致的可遗传的基因表达的变化机制,在不改变基因结构或DNA序列。一个细胞的表观遗传状态演化在有机体的细胞分化和发展,和表观遗传变化是与细胞重新编程。因为表观遗传机制也可能负责集成环境反应在细胞水平上,他们可能发挥重要作用在某些疾病的发展。
图1所示。染色质和表观遗传学机械的简化视图。允许转载[55]
表观遗传调控的基因活动是复杂的,没有完全理解,也许涉及转录因子、生长因子和激素。表观遗传过程也涉及染色质的修改(图1)。组蛋白八聚物,由两个副本的每个组蛋白的蛋白H2A、H2B, H3和H4,包装145 - 147个基点的DNA链,形成核小体核心。多核小体包在一起形成染色质。
表观遗传事件可能涉及了组蛋白的共价修饰,DNA和RNA,以及染色质重塑,微核糖核酸中介和其他改变染色质结构。灵活的氨基端尾组蛋白包含一系列特定站点的转录后修饰(天车)称为“标志”,包括赖氨酸的甲基化和乙酰化,精氨酸的甲基化和磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。天车在组蛋白尾巴形成特定模式,并补充说,阅读和删除特定酶序列,modification-specific的方式,导致额外的标志。存在和/或组蛋白尾巴上没有痕迹提供了独特的停靠站点特定的绑定和/或释放的下游效应蛋白,导致不同生物功能包括转录调控、细胞周期控制、分化和凋亡。
除了组蛋白尾巴修改,DNA甲基化胞嘧啶基地5个位置的构成另一个常见的共价的表观遗传标记,可导致基因沉默。
蛋白质的家庭已确定调解这些修改事件。化学修饰是由“作家”包括组蛋白acetyl-transferases,组蛋白methyltransfersases,组蛋白激酶和DNA methyl-transferases。超过80种不同的作家已确定的蛋白质。标志作为“读者”对接模块包括蛋白质识别特定组蛋白赖氨酸甲基化或acetyated标志。超过300种不同的读者已确定的蛋白质。标志是被“橡皮擦”包括组蛋白去乙酰酶抑制剂和组蛋白demethylases,和大约50个橡皮已确定。
每个模块的分子基础直接写,读,或擦除标志着个体在蛋白质域。这些领域属于蛋白质的家庭有多个成员基于序列或域相似性和作为更大的一部分,他们通常存在多畴的蛋白质和multiprotein复合物。为每个可能的标志,有相应的家庭的作家,橡皮擦和读者的蛋白质。
早期的表观遗传学的研究集中在单domain-single马克的关系,并已经进入研究多个domain-multiple马克交互,以及复杂的关系和信号中所谓的“表观遗传网络。”This means there are hundreds of proteins involved in epigenetic regulation that are potential targets for drug discovery.
表观遗传机制的调制相关的许多疾病,包括癌症、代谢紊乱、炎症、中枢神经系统疾病和病毒感染。酶催化组蛋白天车,包括组蛋白methyl-transferases,组蛋白demethylases,组蛋白乙酰转移酶,而组蛋白去乙酰酶抑制剂,被认为是制药的目标。蛋白质药物结合读者像bromodomains也被研究。
更多关于表观遗传学和药物发现的信息涉及到表观遗传蛋白质,指最近的评论(2、3、7、11、13日,48岁,50岁,55岁,59岁,62年)。
因为染色质绑定和修改活动往往多蛋白复合体的发现,这是一个挑战来描述个人chromatin-binding域。Chromatin-binding蛋白质通常区分组蛋白天车和序列上下文使用微妙的亲和力不同,其功能的关键,而这些细胞化验是很难区分的。理解函数,活动,和特异性chromatin-binding蛋白质,每个交互都需要被定义为一系列的生物化学和生物物理分析。
研究人员可以使用适当的酶化验活动测量许多作家和橡皮擦。这些分析可以使用核提取纯化蛋白质或原油。因为读者蛋白质没有酶活性,研究人员需要测量绑定交互由其它生物化学和生物物理分析。
描述chromatin-binding特异性和亲和力的蛋白质需要看净化模块,与预期的活动,与它交互组蛋白标记,如特定bromodomain读者蛋白质识别和绑定到一个组蛋白肽mono - di -或者triacetylated在特定位置(年代)。在体外生化检测,包括ELISA、芯片(染色质免疫沉淀反应[52]组蛋白肽bead-based拉化验[45],gel-shift化验。一些化验可以用核提取物,而其他人则需要纯化蛋白质。
为目标参与写作,阅读和擦除组蛋白甲基化在药物发现管道、高通量分析支持筛选和复合分析变得更加复杂了。合成组蛋白肽代理人(用适当的标志)是用于高通量histone-binding筛选化验等AlphaScreen®[33,76),AlphaLISA®[83],现场分析(48,51)。一个常见的高通量药物筛选试验是差示扫描荧光测定法(DSF)药物绑定是评估蛋白质热稳定性的变化。
这些生化和大规模筛选分析给出合理的定性信息排序的相对特异性和亲和力。重要的是要记住,定性为histone-binding蛋白质生化检测,存在很多潜在的缺陷的非特异性结合,工件,可靠性和重现性,以及潜在的假阳性和假阴性的结果。例如,AlphaScreen®化验有日常变化问题[32]。
个人的亲和力chromatin-binding交互是专门定义的离解常数的精确测量,KD。K越小D,更严格的约束力的亲和力。K的比较D值绑定的识别是一个重要的组成部分,评估具有约束力的选择性和特异性的家庭相关的蛋白质(如bromodomains)绑定到不同的组蛋白标记。KD值也非常有用的潜在抑制剂的设计和优化。
上面列出的生化和筛选化验不提供精确的KD;根据读出许多等级次序的亲和力(改变颜色,或凝胶带位置或密度),或者仅仅是一个绑定/不绑定的评估。AlphaScreen®化验给集成电路50值有关,但不一样的KD,而现货化验当场给基于相对关联的强度。
关键是任何定性的屏幕是由至少一个生物物理绑定验证分析方法来衡量KD例如,表面等离子体共振(SPR),荧光偏振、微尺度热迁移(MST),或等温滴定量热法(ITC)。生物物理结合化验是正交的主绑定屏幕和提供定量KD测量。这些服务来验证初始筛选数据,以及检测假阳性、假阴性,固有的原始化验和检测限制。染色质的离解常数接口是在摩尔(紧密绑定)的微摩尔的(弱绑定)范围内,和生化分析不能区分相似的低或高结束这个范围。生物物理分析通常需要纯化蛋白质的定量结果。生物物理KD化验可以执行与野生型和突变体蛋白质,和组蛋白多肽与不同的修改以进一步确定选择性的特征和功能。
生物物理分析也提供了更多的信息超出KD,如绑定动力学、热力学绑定和绑定化学计量学。这些测量提供的正交分析,进一步深入了解相互作用的特异性和选择性,绑定机制,活跃绑定的结构域。进一步确认和描述来自x射线晶体学、核磁共振(NMR)和其他结构的研究。
本白皮书讨论ITC的特性分析,并解释如何使用ITC测量KD绑定事件涉及到表观遗传蛋白质和染色质。给出几个案例研究,展示ITC提供的亲和力和其他参数用于描述特定的相互作用,和设计抑制剂。
ITC措施与绑定事件相关的热量变化,确定绑定关联(或KD,离解常数)的生物分子的相互作用。现代ITC毫克分子中的仪器测量KD值(弱关联)个位数摩尔(紧密关联)的范围。绑定焓,熵和结合化学计量学也可以衡量ITC。ITC是用来描述绑定交互涉及蛋白质、核酸和脂类。有最近的评论文章ITC的原理及应用[81]。
ITC成立于生命科学的“黄金标准”研究方法的结合过程,因为它是label-free,敏感,多才多艺,可以用不同的材料在不同的缓冲区。ITC是一个重要的生物物理试验,包括在成千上万的引用在同行评议的期刊。
图2表示ITC是如何工作的。一个绑定合作伙伴(配体)放置在ITC注入注射器,滴定到样品室,混合着第二绑定伙伴(“高分子”)。配体和高分子蛋白质,核酸,小分子化合物、脂类、碳水化合物、金属、或任何其他物质相互作用。约束力的合作伙伴都是在相同的缓冲区。匹配的参比电池通常装满水。
ITC系统编程高分子溶液注入特定的配体在时间间隔。注入注射器还有一个桨在底部,所以混合搅拌在整个实验。
莫尔文工具有几个ITC工具可用,包括MicroCal PEAQ-ITC和MicroCal iTC200。这些都是“补偿”力量异硫氰酸酯,衡量参考和样本细胞之间的温差,并改变热功率补偿温差回零。功率补偿与绑定的热量直接相关。
图2表示中心的原始输出ITC实验。在这个例子中绑定热放热;即负偏差的热量变化代表热量在绑定高分子配体。每个峰值代表单一的配体注入引起的热量变化。的第一个峰值大,因为大多数高分子配体注入是绑定。随着高分子变得饱和配位体,减少配体进一步注资将绑定,因此产生更少的热量。在实验结束时,很少配体必然产生和少量的热量将稀释的热量。
当原始ITC数据上传到ITC数据分析软件,集成基线是自动生成的,每个峰的面积是计算并绘制配体的摩尔比值的函数在细胞大分子。这是显示在图2的权利。黑点代表个人的山峰。弯曲的红线是最好的适合一个绑定算法从我们确定的交互的焓的化学计量学(n值:相关曲线的中点)和亲和力(浓度和相关数据的sigmoidicity)。
KD与吉布斯自由能(∆G)的相互作用方程1:
∆G = RTlnKD(方程1)
R是气体常数和T (K)的温度反应。∆G需要负一个过程发生。绑定关联捂得越紧,越小KD,∆G变得更加负面。
∆G也是相关绑定焓熵(∆H)和绑定由方程(∆S) 2:
∆G =∆H - T∆S(公式2)
绑定焓和熵表征提供了洞察绑定机制,包括参与氢键、疏水作用,和构象变化发生在绑定。热力学和亲和力都是用来描述相关的特异性和结构信息绑定。
图2。ITC是如何工作的。左:ITC细胞和喷射注射器的示意图。中心:代表原始ITC滴定实验的数据。右:代表绑定等温线的ITC实验,符合一套网站绑定模型。
ITC是绑定测定蛋白质参与表观遗传调控。等温滴定量热法已被用于研究数百表观遗传的读者,作家和橡皮过去2年,大部分的这些研究之后,2010年出版。
一些早期研究描述使用ITC识别和描述染色质读者protein-histone交互已经出版[38]30日31日。
有几个原因ITC作为主要结合分析法以及次要/验证试验初始生化筛查试验后:
ITC准确测量KD从毫克分子摩尔的价值观,表观遗传的典型范围蛋白质绑定。
ITC措施与绑定相关联的热交换和是一个普遍的检测系统。这意味着本机蛋白质可以使用,不需要任何标签,标签,标记,或者修改。
ITC是一个真正的溶液中的方法,不需要固定,消除潜在的硬脂/取向问题,以及非特异性结合珠子或其他材料。
ITC不需要任何特定的试剂或抗体,并要求最少的试验开发。
ITC可以执行在本质上任何生物缓冲,包括那些包含常见的添加剂如盐,减少代理商,洗涤剂,代数余子式等。
ITC不需要任何荧光测量,所以不容易受到潜在的荧光技术检测工件。
ITC没有分子量限制,可用于任何大小分子评价protein-small分子,蛋白质,和protein-nucleic酸相互作用,以及多蛋白复合体的大。
ITC结果数据丰富,除了KDITC措施结合热力学和化学计量学,有用在结构生物学,结构活性关系,和药物发现。
设计和软件的改进导致现代仪器更敏感和使用更少的蛋白质相比,早期的异硫氰酸酯,使这项技术更容易使用,更划算。此外,它是一种非破坏性技术,使其能够恢复后的宝贵的蛋白质实验。ITC仪器也可以自动格式来增加吞吐量。
更多信息使用ITC和表征histone-binding蛋白质,指Malecek & Ruthenberg (2012)[45]。
ITC措施之间的绑定染色质蛋白质域和核酸的组成部分。最近的一篇文章中研究哺乳动物5-methylcytosine (5 mc)氧化酶Tet3,并包含一个完整的对碘氧基苯甲醚氨基端CXXC特征域(Tet3FL)[35]。这个CXXC域被确认为一个后生阅读器蛋白质。作为初步绑定屏幕,作者进行了凝胶迁移转变化验使用包含所有已知的寡核苷酸胞嘧啶C5修改:胞嘧啶(C), 5-methylcytosine (5 mc), 5-hydroxymethylcytosine (5 hmc), 5-formylcytosine (5 fc),和5-carboxylcytosine (5 cac)。精确量化的结合亲和力Tet30s CXXC域与修改的DNA和5 cac-modified DNA,作者使用了MicroCal iTC200系统直接测量绑定鼠标Tet3 CXXC域12-mer回文DNA双围绕未经修改的CpG二核苷酸或5 cacpg二核苷酸链(CcaCG DNA)。ITC分析表明mTet3-CXXC域绑定到修改的在20 K的DNAD1.88µM但绑定到CcaCG DNA与紧缩的亲和力(KD0.56µM)。
ITC还用于本研究测量mTet3-CXXC域绑定到12-mer CmCG, CfCG,或ChmCG DNA双取代5 cac与5 mc, 5 fc,或5 hmc。结果表明,mTet3-CXXC域绑定到CmCG和CfCG KD分别为5.59和6.13µM和绑定ChmCG甚至较弱。当5 cac与未改性的C DNA链的取代,导致hemi-carboxylated DNA (hemi-CcaCG),他们观察到一个稍微降低了mTet3-CXXC亲和力,KD1.57µM。更换前5 cac与修改的C T、G也导致了降低绑定关联。ITC数据证实Tet3 CXXC域是一个特定的读者5 cac CcaCG内的DNA序列。
作者选择了几个CcaCG-interacting mTet3-CXXC残留诱变和ITC用来衡量他们影响绑定的mTet3-CXXC向20和CcaCG DNA上的相似之处。的第一个发现是突变H81 CXXC域的丙氨酸取消绑定在20和CcaCG DNA(与之前的结构观察相一致)。其次,K88A突变导致> 27倍弱绑定向CcaCG DNA只有三倍绑定到20。这些观察钢筋K88残留的建议,通过直接与5 cac、互动中扮演着重要角色在特定的识别mTet3-CXXC和CcaCG之间的DNA。第三,mTet3-CXXC T80A和Q82A突变导致小减少向CcaCG DNA(弱)亲和力,符合结构观察,残留导致绑定CcaCG DNA。突变的研究和ITC化验提供我们有力的支持mTet3-CXXC-CcaCG复杂结构的观察。
ITC还用于提供洞察SUVH5 SRA 5-methylcytosine氧化衍生物的识别的领域[61]。集,RING-associated域(SRA)读取表观遗传标记5-methylcytosine (5 mc)基因组DNA。作者ITC绑定和执行结构的研究调查5 mc的识别的分子基础和其他修改,由SRA SUVH5蛋白质域(SUVH5 SRA)。使用MicroCal VP-ITC,他们证明了SRA域绑定到hydroxymethylated CG (5 hmcg) DNA双以类似方式甲基化CG(5微克)。此外,SUVH5 SRA领域表现出较弱的亲和力对羧酸盐CG (5 cacg)和甲酰化CG (5 fcg)。ITC是用来表明SUVH5 SRA承认5 5 mc hmc以类似的方式,但对5 hmc氧化衍生物表现出较弱的亲和力。
有几个期刊文章的引用使用ITC研究交互组蛋白乙酰转移酶结合的衬底,如acetyl-coenzyme或辅酶a[1]代数余子式或组蛋白甲基转移酶绑定,S-adenosyl蛋氨酸[79]。
2014年的一项研究[70]看着后生作家组蛋白H4K20甲基转移酶Suv4-20h2在复杂的组蛋白H4肽底物和S-adenosyl甲硫氨酸(SAM)代数余子式。晶体结构的分析表明,Suv4-20h2活性部位分化的规范域配置和显示出高度的特异性底物和产品。执行甲基转移酶和生化绑定化验,作者表明,酶的Suv4-20家庭monomethylated H4K20衬底和生成一个专门dimethylated产品。作者看着Suv4-20h假字和Suv4-20h突变,绑定到山姆,使用MicroCal iTC200,并观察到类似的KD值(11到17µM)。引用作者的话:“鉴于绑定常量的狭窄范围,山姆绑定不太可能代表一个生理假字之间的显著差异。”The ITC data did show differences in binding enthalpy and entropy, which the authors did not explore further. The thermodynamics could provide additional insight into the binding mechanism of the Suv4-20h to SAM.
大多数后生蛋白质域的相互作用涉及到绑定到特定的组蛋白,所以合成组蛋白通常包含在ITC实验中,以及其他绑定化验。ITC一直用于研究作家如组蛋白甲基转移酶和DNA与组蛋白甲基转移酶的绑定(12日,14日,15日,24日,43岁,79年,85年)。ITC也被用于测量KD几个橡皮擦与组蛋白结合,如组蛋白脱乙酰酶[10],组蛋白赖氨酸demethylase[54],Jumonji域[78]27日28日和Sirtuin蛋白(80、84)。ITC测量KD这些交互的30摩尔到1毫克分子的范围。注意,一些研究也看着不同模块的交互作用,以及与组蛋白的相互作用。
许多研究人员使用ITC描述读者蛋白质绑定组蛋白肽。其中包括14-3-3[77],chromodomain(34岁的30、63、71)博士的手指(5、8,53岁,60岁),PWWP域[74]都铎王朝的领域[6,22岁,49岁,58岁的73年,75年),WD40[46]和叶芝域[41]。
Bromodomains读者的主要类蛋白质,60岁以上的人类蛋白质包含至少一个bromodomain (BRD)模块。惟妙惟肖地识别ε-N-lysine乙酰化组蛋白(Kac)图案。一些研究文章结合ITC数据来研究BRD交互(64年29日31日)。
与结构基因组学科学家联盟(国网公司)近来展开了一次大规模的人类bromodomain家庭的结构分析[18]。他们开发了一个平台,重组惟妙惟肖,和subcloned所有人类惟妙惟肖到细菌表达系统。纯化后的不同BRD蛋白质,他们确定了交互网站与现货肽BRD数组,覆盖所有可能的赖氨酸乙酰化作用(Kac)网站的人类组织蛋白。从现货,他们发现了485惟妙惟肖的单个Kac的相互作用位点与组蛋白肽。证实了绑定ITC实验显示KDµM 3和730之间的值。他们还使用了ITC表明BRD肽识别依赖于多个模式的修改,而不是在一个乙酰化的网站。应该注意的是,K值D与现场试验确定解决方案,ITC(使用cellulose-immobilized组蛋白肽)并不总是关联,表明肽与纤维素支持本研究中使用不允许绑定亲和力的量化。ITC绑定的作者还指出,大多数研究惟妙惟肖和组蛋白之间pepides有约束力的化学计量学1,表明一个BRD模块绑定一个组蛋白肽。然而对于bromodomain BRD4(1)化学计量数为0.5,表明BRD4(1)的两个模块绑定到一个diacetylated组蛋白肽,BRD4(1)一个模块绑定到一个monoacetylated组蛋白肽。
大多数研究人员认为在这个白皮书ITC主要用来测量和验证KD,而另一些人,比如Filippakopoulos et al。(2012)[18],还利用化学计量学特征研究。ITC是唯一的生物物理分析能够测量KD焓、化学计量学和绑定在一个单一的实验。ITC也是唯一的生物物理分析直接措施结合焓∆H。绑定焓与氢键等非共价相互作用。当比较两个绑定实验的结果,如果一个人有更多的负面∆H,这更能表明氢键参与protein-ligand复杂。越来越多的研究人员将热力学以及结构与活性关系的绑定(SAR)分析。
在另一项研究中[36]、国贸、计算和结构的研究来描述不同读者专门识别甲基化赖氨酸残基在蛋白质组蛋白蛋白质。作者使用MicroCal Auto-iTC200获得绑定亲和力和热力学的组蛋白H3K4me3(带正电荷甲基化赖氨酸)H3C4me3(中性carba模拟)和H3G4(中性与甘氨酸,而不是赖氨酸在位置4)多肽蛋白质绑定到五读者明确承认H3K4me3 (JARID1A的锌指博士,BPTF TAF3和都铎王室的域SGF29和JMJD2A)。五个读者口袋中不同的芳香笼组成和架构,使考试的各个组件的具体影响芳香笼上绑定的差异。所有ITC绑定化验的化学计量学1。比较ITC实验H3K4me3协会和H3C4me3表明:
带正电的H3K4me3绑定2 - 33倍更强烈的中性H3C4me3 4 5读者蛋白质包含Trp作为芳香笼的一部分(JARID1A、TAF3 BPTF和JMJD2A(图3和4)
协会Kme3侧链与芳香笼是有利的(负面)焓比中性Cme3协会组织相同的笼子里(图4)
协会的Kme3侧链是有利的(积极)的熵比协会Cme3集团一样的芳香的口袋里(图4)。
ITC绑定和热力学数据,计算和结构的结果,提供证据的存在有利cation-pi交互如图所示的enthalpy-driven协会自然产生Kme3读者的富电子芳香笼蛋白质。
图3。ITC数据JARIDA1A PHD3读者域(上面一行)和TAF3博士读者域(底部行)绑定到组蛋白H3K4me3(左),H3C4me3(中间)和H3G4(右)。的ITC滴定是原始数据,底部是绑定等温线安装一套网站模型。KD值插图。组蛋白的结构是站在最右边。允许转载[36]
相比其他读者,包含至少一个Trp残渣,H3K4me3和H3C4me3绑定到串联都铎域绑定热力学的SGF29相似,表明缺乏(或至少只有一个小的贡献)的cation-pi交互Kme3协会由酪氨酸/ Phe-containing half-aromatic笼的SGF29(图4)。这一结果同意以前的观测cation-pi相互作用的强度取决于芳环的性质。
图4。热力学数据从ITC实验显示绑定5个读者H3K4me3或H3C4me3蛋白质域。蓝色:∆G;绿色:∆H;红色:- t∆年代。消极的价值观是“有利”的过程,积极的价值观”不利。“数据经允许改编[36]
这项工作提供了实验和理论证据表明,读者主要蛋白质识别trimethyllysine通过有利的结合cation-pi交互,并涉及释放的水分子由于协会trimethyllysine侧链。这些信息影响的合理药物设计专门针对trimethyllysine的芳香笼的读者。
表观遗传机制的潜在调制chromatin-binding蛋白质相关的许多疾病,包括癌症、代谢紊乱、炎症、中枢神经系统疾病和病毒感染。
表观遗传的作家、读者和橡皮擦都可以被认为是潜在的制药目标。修改乙酰化和甲基化等特征,和其他机制的更深入地理解修改可能导致未来的药物发现。已经有几个小分子药物抑制后生目标蛋白质,和更多的还在开发过程,有一些已经在诊所。
ITC在药物发现过程中用于验证,优化,和作用机理的研究。KD从国贸、热力学和化学计量学可以用来描述药物绑定和化学点击进入线索[40]20日26日。
开发小分子抑制剂对特定的表观遗传领域是很有挑战性的,特别是对于读者像bromodomains蛋白质,因为目标蛋白质股票与其他蛋白质结构域在相同的表观遗传家庭目标。Filippakopoulos et al。(2010)[19]描述了一种cell-permeable小分子(JQ1)结合bromodomains竞争力。JQ1设计使用已知的结构与活性关系(SAR)的研究。克隆和表达人类所有bromodomains之后,他们筛查绑定JQ1使用差示扫描荧光测定法(DSF)测定热转变。绑定的(+)jq1显著增加的热稳定性bromodomains打赌的家庭,建议紧密绑定。未发现显著的稳定性变化以外的bromodomains打赌家庭,表明这个配体是高度选择性。
从有效性和DSF可以不同蛋白质的敏感性,ITC是用来精确确定绑定常量。光学纯K (+) jq1绑定D大约50和90 nM的第一和第二bromodomains BRD4,分别。可比绑定也是衡量ITC,第一bromodomains BRDT和BRD2三倍较弱的绑定。同时,(+)jq1显示没有检测到绑定ITC bromodomains DSF表现出最小的温度变化。JQ1高效力和特异性对人类的一个子集bromodomains被co-crystal结构BRD4验证。
在活的有机体内研究显示JQ1流离失所的染色质的BRD4癌蛋白融合,促使鳞状分化和特定anti-proliferative影响BRD4-dependent细胞系和异种移植模型。这些数据为目标建立了概念证明表观遗传的蛋白质交互作用的读者和发展提供了一种新的支架bromodomain化学探针的家庭。
波特et al。(2014)[4]“撞和洞”的方法用于设计bromodomains的小分子抑制剂。作者假设他们可以利用化学基因的方法,基于工程形状bromodomain之间的互补性和一个已知的小分子抑制剂(在这种情况下,我敢打赌),并最终生成一个高亲和性bromodomain-ligand变体。
守恒的疏水残留在bromodomain突变是一个较小的残留蛋白质生成一个“洞”。突变是有针对性的与已知的抑制剂类似物我打赌轴承sterically笨重的“碰撞”,可以适应突变的蛋白质。野生型(WT) bromodomains绑定笨重的模拟更弱的空间冲突碰撞,自然产生的残渣。作者开发了一个乙基导数现有的小分子抑制剂我打赌,并显示通过ITC和DSF绑定亮氨酸/丙氨酸突变bromodomains摩尔亲和力选择性高达540倍,相对于野生型bromodomains。绑定焓ITC也是负面的和有利的。细胞培养的研究表明,封锁第一bromodomain就足以取代特定的蛋白质,Brd4,染色质。扩展这种方法有助于识别单一的个人角色选择蛋白质在人类生理和疾病。
其他研究已经使用ITC结合bromodomain抑制剂/探针筛选化验如DSF和AlphaScreen®(9日,16日,21日,37岁,47岁,56岁,57岁的65年,82年)。
ITC也被用来测量KD探针和抑制剂chromodomains等其他后生蛋白质家庭(67、72),组蛋白赖氨酸甲基转移酶(17日42、44),WD40[66],组蛋白脱乙酰酶(68、69)和MBT[25]。
詹姆斯et al。(2013)[32]看着组蛋白的潜在抑制剂methyl-lysine蛋白质L3MBTL3(特制)读者。由于赖氨酸甲基化是一个关键的表观遗传标记,抑制methyl-lysine(特制)结合蛋白可以提高理解这些监管机制和潜在验证特制产品结合蛋白作为药物发现目标。作者从抑制剂UNC1215开始,第一个已知的有力和选择性小分子化学探针methyl-lysine阅读器蛋白质,L3MBTL3。在文章中,他们讨论了设计、合成、和SAR研究导致一个新的抑制剂的发现与改进的选择性,相比,相似的蛋白质。
在这项研究中,对小分子化合物结合亲和力L3MBTL3由一个AlphaScreen®化验,这些绑定趋势经正交时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定。感兴趣的化合物的直接绑定亲和力也证实了使用MicroCal Auto-ITC200。的组合AlphaScreen®、TR-FRET和ITC提供高信心解释报道SAR的趋势。
化合物2和56显示承诺更多的选择性L3MBTL3抑制剂,所以作者使用ITC进一步量化程度的选择性,绑定两个相似的蛋白质比较(表1),化合物1是原复合UNC1215。化合物2绑定L3MBTL3紧缩的亲和力(小KDL3MBTL1相比),导致大约150倍增加选择性。化合物56L3MBTL3更有选择性,ITC选择性大约400倍。相比之下,ITC化合物5的数据表明化合物选择性对L3MBTL1 L3MBTL3 16倍,而化合物1是78倍选择性L3MBTL3 L3MBTL1。一起看结构数据,美国国际贸易委员会的数据,这表明有可能提高有力L3MBTL3的选择性抑制剂通过不同胺结合第一和第二MBT域二聚的绑定模式。
化合物5 |
化合物1 |
化合物2 |
化合物56 |
|
L3MBTL3绑定由AlphaScreen®集成电路50(µM) |
0.071 |
0.064 |
0.17 |
0.13 |
L3MBTL1绑定由AlphaScreen®集成电路50(µM) |
2。9 |
2。3 |
> 10 |
9。6 |
L3MBTL3 / L3MBTL1选择性AlphaScreen® |
41 |
35。4 |
> 59 |
74年 |
由ITC K L3MBTL3绑定D(µM) |
0.38 |
0.12 |
0.47 |
0.35 |
由ITC L3MBTL1绑定KD(µM) |
6.2 |
9。4 |
0.68 |
132年 |
由ITC L3MBTL3 / L3MBTL1选择性 |
16 |
78年 |
145年 |
380年 |
表1。正交分析的结果结合的小分子化合物L3MBTL3和L3MBTL1上的相似之处。数据修改权限[32]
使用生物物理筛选chromatin-binding蛋白质的鉴定,其次是定量KD从国贸值,是一个建立方法看约束力的特异性和选择性。适当的组蛋白肽系列,不同野生型和突变体蛋白的表观遗传家族,ITC可以决定个人的贡献残留或修改总更复杂的底物的亲和力。从ITC将绑定、热力学和化学计量数据,结构像核磁共振的研究和x射线晶体学,在活的有机体内研究,最终将导致一个完整的理解这些复杂的相互作用。生化检查,ITC, SAR和在活的有机体内化验可以在理性药物设计用来创建抑制剂特定读者,作家和橡皮擦的目标。
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