8的技巧提高你的门店库

如何引导

发表:2018年10月22日

对于大多数实验室工作流,你只是一样好你的起始物料。尤其适用于下一代测序(门店)。图书馆质量是最重要的在确保你收到高质量数据的可以是一个长期和艰苦的管道。你总会在图书馆应该由纯化目标DNA序列有足够的产量、最小偏差,和大小均匀分布,并应该成功绑定到适当的测序适配器。有一个日益增长的可用的库列表准备工具,主要是针对特定挥动平台。每个实验平台和每种类型的门店(全基因组外显子组,有针对性、RNA-Seq ChIP-Seq,等等)都需要自己的优化;然而,有几个技巧准备挥动库,适用于所有应用程序。下面我们汇集了一些方便的指针。

使用高质量的原材料

这似乎是显而易见的,但它却经常被忽视。样本可能含有污染物,即使样本提取和纯化。这当然是特别适用于“脏”如粪便拭子样品和环境水样。然而,污染物可以在净化过程中引入本身——例如,一些净化包洗提样品缓冲EDTA浓度高会影响维修,连接酶、聚合酶酶参与图书馆建设。苯酚、氯仿和某些盐也可以产生有害的影响。进一步,你的样品可能包含其他的遗传物质(DNA或RNA),将与你的目标。例如,宿主基因组DNA的存在会影响测序的细菌病原体。因此关键精心选择适当的样本提取和纯化方法来丰富你的目标和减少污染物。

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使用足够的原料

虽然测序平台提供协议对于输入DNA测序低数量的,甚至的单细胞测序,尽可能不适用应小于最小输入DNA制造商推荐的您正在使用的应用程序。这是确保你的关键部分使用一个可靠的DNA / RNA量化方法,不偏向任何其他组件在你的样品。样品也应该远远的线性范围内选择试验,以确保准确的量化。

减少偏见

准备你的图书馆使用的方法和试剂碎片和结扎适配器可能导致测序的偏见。序列扩增子的时候,这是一个特别重要的考虑所使用的引物PCR条件可以导致偏见的代表样本的基因组的某些领域或外显子组。使用酶消化片段样本也可以导致超过或未被充分代表的基因组的特定区域,作为消化酵素偏爱某些序列,为他们的活动。一些基因组领域可能over-digested随后纯化了由此产生的片段太短,而其他人也可能被净化掉under-digested,碎片是太长了。样本的GC含量也会影响扩增步骤,这需要考虑和减轻。获得细胞的DNA提取或检查内生特定蛋白质的水平,通常是通过离心收集细胞。在收集细胞颗粒,不丢弃上层清液进水槽。相反,浮在表面的转移到另一个容器和高压蒸汽或治疗它用漂白剂,以确保所有剩余的上层清液中细胞死亡。然后,您可以丢弃处理上层清液进入水槽。同样,治疗前使用组织培养板用漂白剂处理的生物危害。

优化样品的分散条件

碎片化的时间是至关重要的——太长或太短都将导致减少测序覆盖。这适用于破碎酶消化,声波降解法或声剪切。一些样品在本质上是不稳定的,容易降解,如RNA病毒和mRNA。对于这样的样品,你已经开始“浓缩版”的材料的过程,你需要在库制备过程中要特别小心。

防止交叉污染的样本

当多路复用几个样品测序在单个运行,至关重要的是,你不交叉感染你的样品,因为这将使您的数据。经常改变你的手套,尤其是当你发现任何泄漏;总是改变提示移液步骤之间;小心碰到吸管轴管的内部;旋转管之前打开和使用过滤提示防止样本的误吸移管。基本的,但至关重要的!

记住其他最好的实验室实践

所有示例解决方案应该存储适当的长度取决于样本的类型和存储(4°C DNA的短期存储−20°C的短期存储或长期存储的DNA, RNA和−80°C DNA和RNA的长期存储)。DNA应该存储在一个稍微基本缓冲区,而RNA应存放在RNase-free水。整除样本解决避免反复冻融破坏。用管子做的材料,结合少量的DNA和RNA,防止样品损失。所有工作表面应抹了一个适当的产品在使用前,应采取特别注意当使用RNA核糖核酸酶消化。层流罩指定的工作区域和可能需要防止样品污染。混合试剂在使用前彻底(与酶虽然温和),和工作在冰上。吸管仔细避免体积错误——在可能的情况下,使用主混合减少吸量误差的影响。

准确地量化你的图书馆输出

毕竟所需的工作准备一个好的图书馆,那将是一种耻辱,如果你以后不能准确地量化它的输入下一步测序管道。如果你高估你的图书馆集中,这将导致输入和减少覆盖太少。如果你低估你的图书馆集中,这将导致过多的输入和可导致各种问题取决于平台。当多路复用样本,同样重要的是要正确地正常化汇集不同的库,以确保类似的读每个样本的分布。