与CRISPR-Cas9 9大成功秘诀

CRISPR-Cas9是一项革命性的基因组和外遗传性编辑资源,迅速取代旧的基因组编辑工具。因为这是这样一个新技术,许多科学家和研究人员不太了解其许多错综复杂。这部小说的,想要提高他们的知识工具,从实验室到实验室波澜。如果你适合这一类,或者仅仅是想学习一些技巧和窍门优化CRISPR-based实验,那么这个指南是给你的。

细胞不喜欢双链断裂-

很简单,CRISPR-Cas9 DNA编辑生成一个DNA双链断裂(双边带)指导下一个互补的RNA分子对其基因组的目标。然而,双边带非常细胞毒性,可导致细胞死亡如果不修理。有两种一般细胞修复双边带的方法:通过异源end-joining (NHEJ)或通过homology-directed修复(HDR)。^1、2NHEJ发生在两个裂解的争端解决机构是拴在一起,常常导致随机插入或删除(indels)两股DNA。正因为如此,很难预测结果的确切顺序NHEJ修复。相反,HDR更随机修复机制中,其他染色体上的同源区域争端解决机构作为修复模板。由此产生的序列将其他染色体的序列。在细胞中,机制是用来确保基因组的完整性,但CRISPR-Cas9使用这些方法来生成一个基因编辑感兴趣的。¹

RNA Cas9编辑组件

Cas9需要两个RNA组件正常运行:结构组件在3 '末端(tracrRNA)和第二个组件,指导Cas9乳沟基因组目标(crRNA)位于5 '端。这些可以组合在一起形成一个嵌合single-guide RNA (sgRNA)。^1、2、3本节将重点的设计crRNA或者的一部分sgRNA引导Cas9乳沟。

一般来说,至少20 crRNA必须补充到目标DNA的核苷酸链和一个专NGG Protospacer相邻主题(PAM)序列的3 '末端目标链的3 '末端(这也是crRNA)。crRNA应该是相辅相成的目标序列。然而,补充crRNA之间有某种程度的宽容和目标DNA。^2、3事实上,crRNA可以绑定到目标站点,3或4基地不匹配尤其是序列远离PAM。重要的是,NGG不是20-nucleotide同源性的一部分。目标区域应该包含50% GC内容过于富裕或贫穷GC可以扰乱crRNA瞄准。3一旦gRNA绑定到目标序列,第三和第四核苷酸之间的双边带生成的PAM(即基地17和18 20-base目标序列之间从5 ' 3 '取向)。^2、3从这里,CRISPR-Cas9乳沟事件发生和细胞将尝试修复争端解决机构使用NHEJ或HDR修复途径。

基因淘汰赛和删除

淘汰赛中可以说是最简单的使用CRISPR-Cas9基因编辑生成。简单地生成gRNA,添加Cas9,切!然而,当描述淘汰赛,确保结果indel不是3的倍数,被认为是一个“在坐标系”删除或插入和基因可能仍然正常工作。

删除可以很容易地生成CRISPR-Cas9编辑由于强劲的本质。Cas9只能绑定一个gRNA但不同Cas9分子可以结合不同的gRNA和目标不同的序列。正因为如此,删除可以很容易地形成一个CRISPR-Cas9实验。简单地生成gRNAs上游和下游所需的删除,包括实验。基因染色体倒位和染色体转移也可能使用此策略。

生成单核苷酸多态性

为了生成这些类型的编辑我们利用细胞的先天HDR机制。过程涉及一个Cas9蛋白质gRNA供体DNA模板。当生成一个SNP等位基因或条件,单链DNA低聚糖作为供体DNA模板就足够了。直接适当的DNA修复,50 - 80 bp的同源性武器应该包含在DNA低聚糖。²典型的标准ssDNA合成的最大长度是200个基点,不过有公司可以产生1.5 kb ssDNA是否需要一个更大的敲入。之间的理想的站点(PAM)的第三和第四基地所需的SNP的位置,但如果不是,减少网站应该不超过10 bp远离基地编辑。在供体DNA模板,它是极其重要的,包括某种程度的方差防止Cas9切割之前编辑DNA,因为只要gRNA可以识别互补DNA, Cas9将继续生成双链断裂。^2、3因此,重要的是尝试和定位所需的SNP尽可能接近PAM 1)破坏周围的基地PAM防止gRNA退火,使Cas9乳沟和2)最大化的同源臂所需的编辑。

大型构造敲入

基因插入或磁带插入等较大的编辑在一个特定的轨迹,质粒DNA可以用作供体模板。在这种情况下,同源性武器应该至少800个基点的长度可能超过2 kb。PCR等线性双链DNA片段也可以作为修复模板,但你应该记住,随机线性片段可以融入一些生物体的基因组。大敲入使用CRISPR-Cas9编辑是非常低效的。在这些情况下,它可能是有用的一个大样本大小只有一个或两个细胞可能最终得到所需的敲入。同时,必须消除潜在Cas9削减网站敲入构造gRNA-Cas9复杂将继续产生双边带只要目标序列仍然存在。对于较大的敲入磁带,它可能是有用的,包括一个抗生素抗性标记,荧光标记,或其他一些基因标记来识别细胞可能集成构建到他们的基因组。

CRISPR编辑可以生成多个编辑

所有CRISPR-Cas9事件的根本机制是它劈开DNA在一个网站所引导的RNA分子,然后使用本机细胞机制生成编辑感兴趣的。CRISPR实验,有可能创建一个有用的编辑在一个基因的范围。例如,有一个机会,在一个细胞或胚胎通过NHEJ Cas9双边带修理,生成indels可能导致基因敲除。而在另一个细胞通过HDR争端解决机构可以修复使用DNA供体作为修复模板导致基因的SNP的兴趣。在某些情况下,可以生成biallellic编辑,得到相同的染色体基因敲入或中断,尽管这些实例是罕见的。

基因分型战略开始之前吗

信不信由你,生成CRISPR-editing事件是很容易的。找出产生的基因型在另一方面,可以更多的劳动密集型的。这是一个快速概述的基因分型结果的一些标准方法:

1. PCR检测:这种方法依赖于放大一个基因片段基因组DNA的样本,可以随时用来检测删除或插入。
2. 桑格测序:确定准确的序列,PCR可以测序或片段克隆到质粒测序。桑格测序原始PCR产品的缺点是没有多少数据可以获得一次测序跟踪达到削减网站有机会产生不同的读取两条染色体。需要辨别的序列,克隆非常劳动密集型和可能不是合适的如果筛选多的样品只能克隆一个基因片段从一个染色体每殖民地。
3. Illumina公司下一代测序:这种方法类似于Sanger测序但提供更高的吞吐量,成千上万的个人阅读每PCR片段可以生成最小的劳动的好处。这也否定克隆的需要在每个读然后汇集每个样本提交提供一个大型的数据集。这种方法的问题是,只有短片段,不到400个基点,可以可靠地排序,它可能不是一个有效的方法,如果你只有少数样本特征。
4. 限制消化的PCR产品:这可以使用一次一个indel或如果使用HDR包含一个独特的特征是限制网站的SNP。只是放大了纯化基因组DNA的片段和添加限制性内切酶。确保检查的活动在PCR缓冲以避免PCR限制性内切酶纯化步骤。
5. 表型选择:这可以成为一个抗生素抗性标记,荧光蛋白的生产,或引入非基因的细胞。这些都是最简单的方法来检测您感兴趣的基因的引入,但迄今为止最有效的。这种类型的选择时应只用于引入大敲入或基因盒。

非目标效应

CRISPR并不是一个完美的基因组编辑工具。如前所述,可以有不同的绑定crRNA和基因组目标序列允许crRNA offtarget序列并生成一个双边带退火。然而,进步了缓解可能出现的脱靶效应从CRISPR-Cas9编辑事件。其一,基因组测序库和在线工具可以帮助设计gRNAs减少非目标网站的任何你正试图编辑的基因组。gRNA设计工具,我经常使用CRISPOR服务器(http://crispor。tefor.net/),评估目标活动以及潜在的非目标网站。另外,CCTop服务器(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/is)用于确定目标网站,而CasOFFinder服务器(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)善于寻找潜在目标。大多数生物模型完全基因组测序因此gRNA开发很容易的找到潜在的非目标位点。脱靶效应分析变得更为主流,我们理解的gRNAs选择变得更加清晰。

减少非目标效应的另一种方法是通过修改Cas9蛋白质减少。有两种主要变体的Cas9发达,那里的DNA结合蛋白质的能力大大降低。2这里的逻辑是,将会有更少的非目标编辑如果Cas9蛋白质不能身体与DNA结合,这是真的。回报与这些修改Cas9s crRNA可以不再有任何不匹配与目标序列。Cas9变异与减少DNA结合可以购买下名字Cas9-HF1, eCas9, Alt-R Cas9。

最后一个变体的Cas9减少非目标效应变异,只是尼克DNA而不是生成一个双边带。²攻击DNA阻止NHEJ发生并创建使用HDR优惠,可以修复。这给了一个机会之窗提供供体DNA模板在尼克网站感兴趣的编辑整合到基因组。轻伤的脱靶效应Cas9几乎完全缓解,因为双边带不生成和任何不相干的网站将被修复裂纹最小化。然而,淘汰赛中很少见的基因与轻伤Cas9s通过HDR和维修也减少了,因为它是更容易的细胞修复DNA尼克比投资HDR的能量。

现代CRISPR改编

许多组织使用一种催化地死Cas9 (dCas9)产生表观遗传编辑。^1、4CRISPR-Cas9保持不变的原则:针对Cas9使用gRNA基因组的特定区域,唯一的不同是Cas9的活跃的残留物(天冬氨酸和组氨酸)与丙氨酸取代,使其催化地活动。团体dCas9用来调节基因表达在转录激活物或阻遏蛋白融合。⁴dCas9也被用于表观遗传修饰的组蛋白修饰或DNA甲基化。⁴胞嘧啶核苷脱氨酶也可以融合dCas9生成网站没有生成一个双边带特定碱基替换。绿色荧光蛋白可以融合dCas9跟踪和图像特定染色体上的网站。最后,还有同源蛋白质等Cas9 Cpf1 (Cas12a),也可以产生双边带在基因组DNA,除了产生交错结束。Cpf1还可以识别不同PAM序列,NTTT,扩展了基因组编辑功能。⁵此外,Cas13可以编辑RNA,而不是DNA可能有利于进一步治疗发展没有编辑DNA。⁶

引用

1. Doudna, j . A。,与贝纳(2014)。与CRISPR-Cas9基因组工程的新边疆。科学。doi: 10.1126 / science.1258096
2. 王,W。,俄罗斯,M。&气l . s . (2016)。CRISPR / Cas9基因组编辑和超越。年度回顾生物化学。doi: 10.1146 / annurev -生物化学- 060815 - 014607
3. 诡计,m V。,赢,W。程,a W。,h & Wang (2018)。CRISPR-Cas9-mediated基因组RNA设计编辑和指南。哺乳动物的基因组。doi: 10.1007 / s00335 - 015 - 9565 - z
4. Dominguez, A。Lim, w。气,l . s . (2016)。除了编辑:再利用CRISPR-Cas9精密基因组调控和审讯。自然评论分子细胞生物学。doi: 10.1038 / nrm.2015.2
5. Zetsche B。Gootenberg, j·S。、Abudayyeh O . O。Slaymaker, i M。Makarova, k . S。Essletzbichler, P。中场,s E。Joung, J。van der东,J。Regev,。Koonin, e . V。张,f (2015)。Cpfi是单个RNA-guided类的酶2 CRISPR-Cas系统。细胞。doi: 10.1016 / j.cell.2015.09.038
6. 考克斯,d . B。Gootenberg, j·S。、Abudayyeh O . O。富兰克林,B。柯尔尼,m . J。Joung, J。&张,f (2017)。与CRISPR-Cas13 RNA编辑。科学。doi: 10.1126 / science.aaq0180