3从小鼠脑组织中提取RNA的顶端秘诀

核糖核酸(RNA)对基因调控和表达至关重要。这就是为什么它的提取是一个基因表达分析的重要组成部分。在许多神经科学研究中,老鼠等动物模型使用。因此,你可能会发现,你必须从小鼠脑组织中提取RNA或其他。虽然萃取过程本身并不复杂,两个挑战出现在从老鼠大脑中提取RNA样本。第一个挑战是,比使用DNA与RNA强硬,因为RNA天生就不太稳定,由于其化学结构。在更高的温度不稳定(> 65°C)和可降解金属离子的存在或在碱性条件下。此外,rna更无处不在的标准比dna实验室条件下。即使是最轻微的接触RNA核糖核酸酶会影响稳定。rna是有问题的,因为他们是耐高温和化学处理。 The second challenge faced when extracting RNA from mouse brain is the nature of the tissue. In general, isolating intact total RNA is more difficult when processing certain problematic tissues, such as lipid and protein-rich tissues and fibrous tissues. The brain falls under this category due to its high lipid content. This guide outlines the main precautions you should take to overcome these challenges. It’s meant to supplement your main extraction lab manual. If you would like to read further on the topic, please check references 3 and 4.

实验室制备

在开始工作之前,你的实验室应该妥善准备使用RNA。如前所述,RNA可能非常脆弱,如果处理不当,RNA是出了名的难以去除。有四个因素注意当你准备实验室:pH值、温度、金属离子和rna。

1。 指定一个区域为RNA提取:这是特别有用如果你工作在一个共享实验室。刚刚实验室的一部分指定RNA提取核糖核酸酶污染来源和处理限制。

2。 使用一次性的核糖核酸酶免费塑料制品:塑料制品上的标签必须显式地指出这是“RNase-free。“不要以为RNase-free是因为它的无菌消毒不摆脱rna。此外,使用的吸管技巧应该包含一个过滤器来防止污染。(注意:如果你想用玻璃器皿,它应该是烤+ 180°C + 200°C至少4小时。高压灭菌法不会摆脱rna。)

3所示。 治疗与EDTA可重复使用的塑料制品:如果你打算使用可重复使用的塑料制品,必须浸泡(2小时,+ 37°C)在0.1 M氢氧化钠/ 1毫米EDTA(或绝对乙醇与1% SDS)摆脱任何金属离子。然后用DEPC-treated冲洗水和热量为15分钟+ 100°C。

4所示。收集所有您的实验室设备:确保所有你将使用的设备是可用的和易于访问。你不想争夺一个吸管mid-extraction。

5。 清洁实验室和设备:确保清洁所有的长椅,吸量管等RNA提取区域使用100%的乙醇或商业核糖核酸酶灭活剂。同时,储备所用的所有化学物质用于RNA RNA提取和分析应用程序。

6。 总是保持低温度:所有的RNA样品应保持在0 - 4°C,和他们一起工作。这就是为什么重要的是要确保你总是手头有冰之前收集样本从存储或删除它们。

样品采集和处理

1。总是穿防护服:手套、实验服,安全眼镜应该总是穿。虽然这是标准的实验室程序,它变得越来越重要时提取RNA保存样本的完整性和安全(尤其是当使用有机提取)。核糖核酸酶污染的主要来源是人体皮肤,所以一定要戴手套整个时间你正在提取。此外,不要碰任何东西在RNA提取区域,防止转移核糖核酸酶。

2。 样本收集:你应该确保你收集你的样品迅速,组织及时治疗通过flash冻结,RNAlater或均化缓冲防止激活内源性rna。

3所示。组织解剖:如果大脑的某些部分,如必须隔离,纹状体和海马解剖必须迅速冷冻RNase-free表面。如果大脑组织离开太长(> 5分钟。)或其温度上升,RNA内生核糖核酸酶降解增加的风险。

4所示。均化:

• 均化之前,确保你的均质器干净从所有脂肪残留物之前使用。此外,确保所有部件RNase-free,把每个部分根据其材料(见分2、3和5在实验室准备。)
• 确保你的组织是彻底的均质。均化缓冲应该变得浑浊,没有可见的组织部分暂停。
• 脑组织富含脂肪,你必须采取一个额外的步骤来消除脂肪物质从你的样品。均质化后,离心样本为12000 x g 10分钟4°C。

颗粒形成底部的管包含细胞外物质,高分子量DNA,和多糖,而上层的上面一层脂肪收集。丢弃的脂肪层和收集上层清液继续提取提取设备的方向。

5。储存:

• 在组织:组织应该flash在液态氮冷冻,保存在-80°C。不要让大脑组织解冻,即使提取,因为这可能导致你的RNA降解。商业存储介质也可以。例如,大脑组织可以存储在RNAlater在-20°C。
• 提取RNA, RNA应该存储在-80°C。如果您希望存储RNA很长一段时间(年),它应该保存在乙醇整除在-20°C或-80°C。

故障排除

问题	可能的原因	操作
低良率	不完整的均质化	使用一个较小的组织和肉 它以确保它是完全沉浸在 均化缓冲区。
降解RNA	处理不当	作为降解RNA不能使用,你 将不得不做一个提取。支付 特别注意温度和 核糖核酸酶污染。
受污染的RNA	广义相分离	处理DNase去除残留 基因组DNA。 使用柱净化净化。

引用

1. Chomczynski, P。&萨基,n(无日期)。单步方法的RNA隔离酸胍盐Thiocyanate-Phenol-Chloroform提取、4。
2. 约翰逊,美国。,摩根·d·G。&雀,c, e (1986)。广泛的后期稳定的RNA从老鼠和人类大脑。《神经科学》杂志上的研究中,16 (1),267 - 280。https://doi.org/10.1002/jnr.490160123
3. 小,r . e . f . (2009)。RNA的方法:实验室指南隔离和表征。学术出版社。
4. h·尼尔森(2011)。使用RNA。在分子生物学方法(克利夫顿,新泽西州),703年,15-28。https://doi。org/10.1007/978 - 1 - 59745 - 248 - 9 - _2
5. trizol_reagent.pdf。(无日期)。从http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_ reagent.pdf检索