细胞治疗质量控制关键技术“，
细胞疗法的发展是为了治疗广泛的疾病和疑难杂症。质量控制(QC)技术和方案需要支持免疫疗法和再生医学的发展。为基于细胞的治疗产品的质量控制制定适当的监管标准对于保护接受此类治疗的患者和保护该行业至关重要。例如，无证、自诩的“干细胞诊所”对患者造成严重不良影响;据报道，有一例患者以为自己在参加一项临床试验，但却花钱接受了双侧玻璃体内注射，导致视力下降。1这些案例也会损害合法干细胞研究的声誉。
就像使用个性化的方法来治疗患者一样，可能没有“一刀切”的程序来评估细胞治疗制造中的QC。
为了鼓励业界就“质量”的含义达成一致，全球诱导多能干细胞(iPSC)治疗联盟(步态)对成员进行了调查，以了解他们如何理解临床级iPSC系作为异体治疗开发起始材料的关键质量属性。以下是iPSCs的关键质量属性:2
● 身份(原始描述的真实基因型和表型)
● 微生物无菌(支原体、细菌学和病毒检测)
● 内毒素
● 遗传保真度和稳定性
● 生存能力
● 描述
●
效力
对于评估上述清单的确切参数、测定方法和标准，人们意见不一，但专家们一致认为:整体QC策略不应仅依赖成品测试。相反，它应该包含整个制造过程。
在这个列表中，我们探讨了细胞治疗QC中的一些最新关键技术，旨在解决上述属性。
1）评估起始材料的测试
细胞治疗产品的安全性和有效性在很大程度上取决于其来源的起始材料的质量。理想情况下，应该有一个国际公认的“标准”来构成“临床级”iPSC线。为了实现这一目标，制药行业必须就关键质量属性达成一致，并将许多因素考虑在内，包括鉴别、稳定性、生存能力、效力和无菌性。这可能会补充现有的与主细胞库相关的标准分析。原料质量控制分析的例子包括:
核型分析
核型分析或“核型分析”是对所有染色体进行配对和排序的过程，用于评估多能干细胞是否积累了培养驱动突变。可以观察到大致的遗传变化，以及更细微的变化，包括缺失、重复、易位或倒置。3.
多能性测试
我们如何确定iPSCs实际上是多能的?多能干细胞的定义是它们能够分化成三种胚层中的任何一种细胞，因此进行这种分化测试是一种方法。多能性标志物可用于预测具有“功能性多能性”的细胞，用于流式细胞术和免疫组化。流式细胞仪需要验证的分析模板，因为流量阈值标记涉及一些主观性。2、4
短串联重复分析
细胞的短串联重复序列(STR)基因分型用于评估DNA的特定重复片段，通常长度为2到6个碱基对，称为短串联重复片段 str 。STR基因分型可用于区分DNA图谱和细胞和组织的常规鉴定。检测应由经认可的实验室使用市售试剂盒进行。2
2）单细胞转录组学
下一代测序(NGS)极大地提高了我们对不同病理和疾病风险的理解，同时实现了新的诊断能力。然而，由于深入的转录组分析需要对大量细胞进行分析，传统的大群体测序只能提供一组细胞的平均表达信号。5由于来自特定组织的细胞不一定是同质的，重要的细胞间差异性可能会被忽略。
单细胞转录组学可以改变这一点，而且确实如此 见过 成为细胞治疗QC最有前途的新兴技术之一。细胞治疗行业的主要优先事项之一是识别定义细胞状态差异的基因和途径，而单细胞转录组学可以通过使研究人员能够:5、6
● 识别生产过程中用于细胞监测和控制的标记面板
● 追踪发育中不同细胞谱系的轨迹
● 揭示基因之间的调节关系
● 分类细胞并研究它们的聚类
●
鉴定稀有细胞群
单细胞RNA测序(sc-RNA-seq)协议允许一次性描述数千个单细胞的转录谱，7以及DNA甲基化的研究，8组蛋白修饰9还有染色质可及性。9scRNA-seq技术在细胞分离和标记的方式上有所不同，但它们通常都在相同的一般过程中工作;细胞被分离，裂解，RNA被逆转录成cDNA使用独特的条形码纳米颗粒。在第二链合成后，通过聚合酶链反应扩增cDNA，然后使用NGS进行测序。5通过追踪独特的条形码纳米颗粒，研究人员可以跟踪哪些转录本来自哪些细胞。
3)定量软件分析活细胞成像数据
多能干细胞以其分化成不同细胞类型的潜力以及在再生医学中的许多可能应用而闻名。多能干细胞，包括多能干细胞和胚胎干细胞，在分化成特定谱系的倾向上各不相同。10因此，需要一个选择过程来确保具有高多能性的多能干细胞是用于再生医学的干细胞。
理想情况下，选择过程应该是廉价、快速和相对轻松的。虽然很可能会使用一系列技术来识别所需的细胞，但QC列车的第一站可能是活细胞成像。与 细胞显微技术的重大进展 在美国，科学家们现在可以可视化细胞器，绘制染色体位点的运动图，并感知机械力。
尽管活细胞成像具有巨大的功能，但决定如何管理和使用生成的数据是另一个挑战。开发能够让科学家在质量控制过程中做出自信决策的算法是该领域的主要优先事项。最近的一篇论文科学报告描述了一种成像系统的发展，使定量评估的程度的体细胞重编程和多能干细胞分化。11通过“相位分布”指数的生成，多能干细胞可以以一种非侵入性和无偏倚的方式被分组为具有高或低多能性的菌落。
4）评估肿瘤发生的工具
人类胚胎细胞被比作一把“双刃剑”;使它们能够自我更新并分化成三胚层细胞的特性也使它们致瘤性。12当注射到免疫缺陷小鼠体内时，人类胚胎干细胞会形成良性生殖细胞肿瘤，即畸胎瘤。13虽然它们不完全相同，但人类的诱导多能干细胞也有共同的致瘤特性。12这是一个关键的安全障碍，因为未分化的多能干细胞持续存在于最终产物中，可能会引发移植患者的肿瘤发展。4细胞转化或基因组不稳定等其他因素也可促进肿瘤的发生。
因此，需要工具来评估细胞疗法的致瘤潜力。尽管越来越多的细胞治疗产品进入临床试验，但目前对肿瘤性评估的最佳方法尚无全球共识。14有鉴于此，健康与环境科学研究所(HESI，一个非营利性机构)成立了一个委员会，以生成基于科学的证据，以就评估肿瘤发生性的策略达成共识(CT-TRACS:细胞治疗跟踪，循环和安全性)。
2019年，CT-TRACS委员会发表了一份立场文件Cytotherapy这突出了当前可用方法的局限性和可能的未来方向。4他们指出:
● 致瘤性检测理论上是指检测最终产品中残留的未分化细胞或转化细胞，两者都被视为最终分化细胞治疗产品的“污染物”或“杂质”
● 由于细胞疗法的复杂性，很可能会针对单个细胞产品在个案基础上开发一套致瘤性测试
●
细胞致瘤性不同于细胞致癌性
目前可用的技术
体内试验
几种免疫功能低下的动物模型为在活的有机体内致瘤性评估，只要证明移植细胞产物的植入和存活就可以成功证明。4就像在体外测试中，对于显示细胞不太可能形成肿瘤所需的参数没有全球共识。
在体外 测试:
下表列出了可用于检测肿瘤发生的不同方面的方法:4
方法 |
用于检测 |
流式细胞术，定量RT-PCR，液滴数字PCR，高效培养多能干细胞，检测释放到培养基中的标记分子 |
多能干细胞 |
细胞增殖试验 |
永生化细胞 |
数字软琼脂菌落形成试验 |
不依赖于锚定的细胞生长 |
核型分析，阵列比较基因组杂交，荧光原位杂交,上天 |
基因组不稳定性 |
新兴技术:芯片上的器官
芯片上的器官技术可以用来模拟组织移植到患者来源的细胞中，并识别肿瘤的发展。15虽然这种方法还处于发展的早期阶段，但几项概念验证研究已经显示了它的潜力。
5)无菌检查
与一些生物制药产品不同，细胞治疗产品不能通过最后的无菌过滤步骤。此外，细胞治疗产品有限的产品保质期构成了额外的挑战。这就产生了对快速微生物方法的需求，以确保在制造过程中去除污染物。虽然有一系列的测试可以识别支原体、细菌和病毒，但快速qPCR是一种特别有前途的测试。去年，一种快速qPCR检测支原体的方法获得了美国食品和药物管理局、加拿大卫生部和欧洲药品管理局的批准，可用于临床CAR-T产品 研究。16
建立细胞治疗QC协议需要业界就参数和分析的标准化达成共识。了解特定突变、通道数和其他因素的影响将有助于指导行业找到最合适的技术和质量参数。
引用:
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