DNA修复后CRISPR不是我们的想法

尽管有很高的期望和高投资CRISPR-Cas9基因编辑,科学家们仍然有很多人类了解它是如何工作的。

在最新的例子中,加州大学伯克利分校的科学家发现人们的假设关于细胞修复Cas9酶剪后的基因组DNA是错误的。

发现为深入了解为什么CRISPR-Cas9基因在几乎每一个细胞都试图编辑工作非常好,虽然不是在所有细胞以同样的成功。并且它可以帮助研究人员提高电池的效率将新的DNA插入到基因组——取代有害突变与正确的DNA序列,例如,通常调整CRISPR-Cas9编辑得到期望的结果。

“如果你想治疗镰状细胞性贫血,你成功的机会纠缠不清的效率可以取代镰状细胞基因突变与正确的一个,”加州大学伯克利分校的博士后研究员克里斯·理查森说,一篇论文的第一作者描述结果。“如果你收获一百万个细胞从一个病人,你有插入率10%,不如如果你有30到40%。能够操纵这些细胞增加的频率这一过程,称为homology-directed修复,是令人兴奋的。”

“基因编辑超级强大,很多承诺,但是,到目前为止,大量的试验和错误。在人类细胞中它的工作方式是一个黑盒的假设,”主要作者雅各说玉米,一个加州大学伯克利分校的分子和细胞生物学的兼职教授。“我们终于开始得到的照片是怎么回事。”

玉米、理查德森和他们的同事将公布他们的研究结果在8月出版的《自然遗传学》网上了。

玉米是直到最近,科学创新的生物医学基因组学研究所主任,联合CRISPR研究项目在加州大学伯克利分校和加州大学旧金山。今年秋天,他将加入在苏黎世ETH的教员,瑞士。

CRISPR依赖于DNA修复

CRISPR-Cas9革命,因为它的精度在特定DNA序列的基因组中数十亿,劈开双链DNA分子。但在那之后,由细胞去修理损坏的地方。

修复可以发生在两个方面。酶可以缝合晃来晃去的目的,往往导致一个或多个基地——DNA的基石——被添加或删除,扰乱基因的功能。另外,其他酶可以修补与一条DNA链相匹配的DNA序列上游和下游的削减。创建一个互补的DNA链完成双线修复。

前者称为异源end-joining,似乎CRISPR切割后最常见的结果。后者,homology-directed修复,比其他人更频繁地发生在某些类型的细胞,而且需要一段DNA的存在,可用于修补破裂。研究人员通常提供一个单链DNA片段,希望细胞用它来取代错误的序列与新的。

两个进程都有点神秘,然而,没有人知道为什么有些DNA的细胞容易补丁而其他人很少这样做。

“使用CRISPR-Cas9医学的热情或合成生物学应用程序是伟大的,但没有人真正知道会发生什么你把它进入细胞后,”理查森说。“它并创建这些优惠和你依靠细胞修复它们。但是人们并不真正了解这一过程是如何工作的。”

找出哪些DNA修复酶是关键homology-directed修复后CRISPR切割、理查德森和玉米采用CRISPR干扰技术(CRISPRi)摧毁,一次一个,超过2000个基因已知或疑似参与DNA修复,一个函数至关重要的健康的细胞。

令人惊讶的是,许多基因被证明是重要的——homology-directed修复急剧下降时沉默——参与一个重要的修复系统不认为参与CRISPR修复。

Fanconi贫血

途径包括21个不同的蛋白质和叫做Fanconi贫血通路,因为如果任何这些蛋白质基因受损,人们开发Fanconi贫血,一个罕见但严重的遗传性疾病的骨髓不能让足够多的新的血细胞。与出生缺陷相关,较高的患癌症的风险,包括在儿童患白血病的几率10%。一些病人活过30岁。

通路已经认识和研究了几十年,但它在很大程度上是理解修复一个特定类型的DNA损伤:DNA交联interstrand,在一条链上一个核苷酸的DNA债券紧密相邻的核苷酸链,干扰DNA复制和经常杀死细胞。研究人员在1980年代曾报道homology-directed修复和Fanconi贫血通路之间的连接,但它被忽视或误解,玉米。

“基于我们的工作,我们相信Fanconi贫血通路中起着重要作用在解决其他类型的病变,但最好理解为维修双链断裂的途径,”理查森说。“Cas9编辑之后,Fanconi贫血通路是必需的,如果你想插入新的DNA。”

Fanconi贫血通路的重要性在修复CRISPR优惠让人们怀疑一些计划CRISPR治疗疾病本身,然而。没有一个活跃的Fanconi贫血途径,细胞可能无法取代突变基因与正常基因后Cas9削减。

事实上,Fanconi贫血通路的水平的活动可能会影响有效CRISPR如何插入DNA在一个特定的细胞。研究人员得出结论,尽管end-joining是默认的双链断裂后修复机制,Fanconi贫血通路与它竞争,更高的活动导致更多homology-directed end-joining修复和少。

癌症治疗

虽然这些发现帮助科学家更好地理解人类细胞的DNA修复机制,他们也可以帮助研究人员开发抗癌疗法在肿瘤细胞DNA修复目标。因为其他因素现在似乎参与双链断裂的修复,这项研究扩展了的蛋白质列表可以misregulated为了搞砸了DNA修复癌细胞,使他们更容易死亡。

理查森还发现,21个蛋白质的途径之一,FANCD2,总是在网站上的双链打破由CRISPR-Cas9,表明它起着重要的作用在调节新DNA的插入到基因组的网站。FANCD2可以调整增加的频率通过homology-directed细胞插入DNA修复。

”也,因为FANCD2本地化Cas9优惠的网站,您可以使用FANCD2地图Cas9正在削减在任何细胞,”理查森说。“如果你编辑一个人口的细胞和你想知道削减和非目标在哪里,你可以地图FANCD2基因组中被发现,你可以找到削减。”

“整个Fanconi贫血通路影响end-joining之间的平衡和homology-directed修理;它就像一个交通警察,“玉米说。“所以患者的基因型会影响你如何做基因编辑。”

这篇文章被转载材料所提供的加州大学伯克利分校。注:材料可能是长度和内容的编辑。为进一步的信息,请联系引用源。

参考:理查森,c, D。、Kazane k·R。冯,s . J。泽林,E。布雷,n . L。谢弗,a·J。,…玉米,j . e . (2018)。通过Fanconi CRISPR-Cas9基因组编辑在人类细胞发生贫血的途径。自然遗传学,1。https://doi.org/10.1038/s41588 - 018 - 0174 - 0