利用Edit-R CRISPR特异性工具对CRISPR- cas9基因组脱靶进行完全比对鉴定，并对位置错配耐受进行全面分析

CRISPR-Cas9系统具有推进基础和应用研究的潜力;然而，rna定向DNA切割事件的特异性尚未完全了解，这可能阻碍其更广泛的应用。关于脱靶效应及其决定因素的新发现正在频繁地被报道。最近的工作已经证明了通过含有多达4个核苷酸凸起的CRISPR rna (crRNAs)进行基因编辑，但现有的设计工具无法基于间隙对齐检测假定的脱靶。我们提出了Dharmacon™Edit-R™CRISPR特异性工具，这是一个简单的网络工具，利用特征良好的对齐优化技术来执行快速、可定制和完整的crRNA特异性检查，包括间隙检测。Edit-R CRISPR特异性工具可免费获取dharmacon.gelifesciences.com/tools-and-calculators/crispr-specificity-tool此外，我们使用Cas9、合成crrna和合成tracrRNA的三组分平台全面评估了CRISPR系统的位置脱靶倾向。我们对含有两个核苷酸错配的两种功能crrna进行了系统的位置筛选。高通量报告试验的应用直接测量了一个中心细胞过程的功能活性(泛素-蛋白酶体活性)，允许测量每个crRNA的所有破坏性两错配组合的相对裂解活性(每个序列190个组合或总共380个组合)，而不管是否需要脱靶靶区域自然发生在PAM邻近的基因组中。我们的研究结果表明，虽然脱靶确实发生在crRNA和靶DNA之间存在两种错配的情况下，但功能脱靶的总体水平相对于靶向活性较低。对耐受错配位点的分析进一步阐明了CRISPR-Cas9脱靶的机制，并为哺乳动物基因编辑提供了额外的crRNA设计规则。 These studies demonstrate the simplicity and high-throughput nature of this three-component system for elucidation of CRISPR-Cas9 function and mechanism.