高精度的HCV基因分型:靶向下一代测序

HCV基因型(GT)的测定为HCV感染治疗方案的制定提供了重要的信息。DNA杂交采用线探针检测格式(VERSANT HCV基因型2.0 LiPA)，首次引入约20年前，仍然是最广泛使用的实验室方法。最近快速发展的下一代测序(NGS)技术使分析病毒基因组的速度和准确性达到了前所未有的水平，为进一步提高丙型肝炎的诊断基因分型开辟了新的途径。

我们将NGS与从样本制备到结果报告的工作流程自动化相结合，证明了临床样本中GT评估的高准确性。这个新开发的平台基于epMotion 5075机器人系统(Eppendorf，德国)的定制版本，包括一个连续的机器人过程，从血浆或血清提取和RT-PCR开始，然后是自动化文库制备、Ion Torrent深度测序和直接在线数据分析，以确定HCV GTs。我们使用了HCV NS3、NS5A和NS5B区域的靶标序列，而不像常用的5’utr区域，其局限性是众所周知的。结果与从相同样品中获得的线探针测定数据进行比较。随机选取143例亚洲和7例非洲慢性HCV感染患者的存档血清或血浆样本，病毒载量从5.50x102至1.04x108 IU/mL(中位数6.10x106)纳入研究。GT分布如下:11 GT1a, 14 GT1b, 12 GT2, 58 GT3, 9 GT4, 7 GT5, 39 GT6。在16/150(11%)的样本中，两种方法的结果不一致。Sanger测序证实，VERSANT在主要GT水平上的鉴别能力为89.3% (95%CI: 83.4 - 93.3)， NGS为100% (95%CI: 97.5-100)。正确的GT亚型呼叫VERSANT为89%，NGS为100%。在16个不一致的样本中，8个GT6被线探针错误地归类为GT1b, 6个GT3被错误地归类为GT4，另外2个GT3被错误地归类为GT6。

总之，考虑到正确的基因分型在HCV治疗管理中的关键作用，工作流自动化HCV NGS似乎是区分HCV GTs的一个高度可靠的工具，可以帮助防止可能导致次优治疗的诊断错误。

更重要的是，文库生成的DNA contigs完全可供用户进行进一步的序列分析，例如，能够评估针对正在调查的病例的额外突变。这一额外的特征可能有助于监测对新药物治疗的耐药性。