Homology-directed修复与Dharmacon™Edit-R™CRISPR-Cas9和单链DNA寡核苷酸

CRISPR-Cas9系统来源于酿脓链球菌使用Cas9核酸酶蛋白复合物tracrRNA和针对crRNA包含20个核苷酸引导序列互补基因感兴趣的目标,创造双链DNA断裂。一旦发生双链断裂,哺乳动物细胞利用内生机制修复破碎的基因组DNA。在捐赠者序列的存在,双链断裂可以使用homology-directed精确修理修理(HDR)导致所需的插入或兄弟。这里我们演示使用单链DNA合成低聚糖捐助者在小说基因编辑(Dharmacon™Edit-R™)平台组成的合成tracrRNA和crRNAs程序Cas9执行HDR核酸酶,导致精确的插入短DNA序列。通过仔细lipid-based优化转染条件,我们可以利用这个平台来创建兄弟与效率高达25%。我们评估几个参数影响HDR效率包括单链DNA同源臂的长度需要低聚糖捐献者。我们的数据表明,HDR能够执行插入10 - 12核苷酸序列与20个核苷酸同源性武器。我们另外提供实验工作流执行在一个简单而有效的lipid-based HDR转染96孔板格式。提出的方法可以应用于HDR-based内插入表位标记,如国旗标签,单核苷酸多态性,精确停止密码子,氨基酸酶的活性部位的变化。