通过选择合适的CRISPR-Cas9试剂提高真核细胞系的基因编辑效率

活细胞的基因工程对于理解正常和患病状态下的基因功能至关重要。CRISPR-Cas9系统因其与其他基因编辑方法相比易于使用而得到广泛应用。该系统需要Cas9蛋白与tracrRNA和基因靶向crRNA的复合体，在基因组的特定位置引入双链DNA断裂，以破坏蛋白质翻译和敲除基因功能。为了实现高基因编辑效率，选择最好的CRISPR-Cas9试剂在感兴趣的细胞中传递和表达是至关重要的。根据特定细胞的可转染性，CRISPR组件可以通过质粒转染或慢病毒转导来传递。质粒表达的Cas9可以与合成的crRNA和tracrRNA共转染，在脂质传递的细胞中进行有效的基因编辑。被包装成慢病毒颗粒的Cas9可以被转导到不易转染的细胞中。慢病毒Cas9也可用于生成稳定的细胞系，然后可以通过合成或基于慢病毒的CRISPR RNA成分转染或转导这些细胞系;这对于筛选应用程序特别有用。重要的是，在不同的细胞类型中表达来自不同启动子(如人类和小鼠CMV和EF1α， PGK, CAG)的人源化Cas9会导致不同水平的Cas9表达，从而导致不同的基因编辑效率。 In addition, cells transfected or transduced with gene editing reagents can be enriched by antibiotic selection or FACS using reagents in which the Cas9 gene is co-expressed with either an antibiotic resistance marker or a fluorescent protein reporter. This enrichment facilitates the isolation of clonal cells containing the desired mutation. Presented here are data demonstrating improvement of gene editing efficiencies in cells of interest by using the most effective delivery and selection approaches with the optimal CRISPR-Cas9 reagents.