利用CRISPR-Cas9系统配对合成crrna敲除microRNAs

源自化脓性链球菌的CRISPR(聚集规则间隔短回文重复序列)-Cas9 (CRISPR-associated 9)系统使用由引导RNA (gRNA)指导的Cas9核酸酶在目标位点上创建DNA双链断裂(DSB)。grna可以是双重合成分子，如含有CRISPR RNA (crRNA)和反式激活CRISPR RNA (tracrRNA)的原生细菌系统(图1)，或单个合成引导RNA (sgRNA)。DSB通常通过哺乳动物细胞内的内源性机制通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进行修复。NHEJ可以导致插入或删除(indels)，通过无义突变或引入终止密码子产生功能基因敲除。当使用CRISPR-Cas9组件靶向编码基因时，通常有多个原间隔相邻基序(PAM)序列(NGG用于化脓性链球菌)沿基因选择来设计gRNA。对于大多数CRISPR Cas9基因组工程实验，一个靶向gRNA就足以产生所需的功能基因敲除。然而，对于某些应用，使用两个grna来产生更大的缺失并确保基因敲除或去除一个外显子、长非编码RNA (lncRNA)或转录调节元件可能是有利的。