漫长的一天的晚上:从事结构生物学的前线COVID-19倍
加里Buchko博士是一个物理生物化学家在太平洋西北国家实验室(PNNL)在实验室里,他开始他的职业生涯的迈克尔•肯尼迪博士使用核磁共振光谱学研究DNA修复蛋白。
在过去的二十年里,他已经使用核磁共振光谱学解决方案的结构和特征大套房的蛋白质的功能。尽管多日,在实验室度过的,他的好奇心的领域显然并没有动摇。正如他所说:“谁支付给工作在他们的爱好上?”
自2007年以来,大部分Buchko西雅图的研究工作一直致力于结构基因组学中心传染病(SSGCID),两种结构基因组学中心建立的国家过敏症和传染病研究所。
他的作品与SSGCID涉及确定蛋白质的三维结构导致人类传染病的病原体。
在最初爆发COVID-19和病毒的测序的基因组,Buchko和同事快速组装优先结构基因组学努力专注于从SARS-CoV-2破译重要的蛋白质结构。
在这次采访中,Buchko雄辩地讨论他的研究领域,它的一位科学家在这个领域在当前全球大流行,和他的团队将如何继续推动科学研究的前沿保持领先一步的其他传染病的可能。
莫莉·坎贝尔(MC):请您能告诉我们关于你的研究背景和工作在西雅图结构基因组学中心传染病吗?
加里Buchko (GB):在太平洋西北国家实验室在过去的二十年里我使用核磁共振光谱学解决方案结构和描述一套广泛的蛋白质的功能。自2007年以来,这包括一个重要的努力奉献西雅图结构基因组学中心传染病(SSGCID),两种结构基因组学中心建立的国家过敏症和传染病研究所(NIAID)来确定病原体的蛋白质的三维结构导致人类传染病。
两个中心积极参与社区传染病研究人员选择请求目标进入它们的结构测定管道和协作解释和发布的结果成功的结构决定。SSGCID目标选择专注于重要的酶,毒力因素,药物靶点,并从众多候选疫苗细菌、真核生物和病毒病原体。一般来说,目标基因PCR扩增、克隆和筛选可溶性表达大肠杆菌。蛋白质纯化在毫克,结晶的筛查,x射线衍射分析了使用一个内部源或非现场同步beamline。解决解决蛋白质结构不能结晶,蛋白质< 25 kDa分子量由NMR排队结构确定,最近,选定目标> ~ 100 kDa是低温电子显微镜的排队。
项目《盗梦空间》在2007年年底以来,超过6000个目标进入SSGCID结构测定管道,其中> 4000社区请求,导致近1300蛋白的沉积结构的蛋白质数据库(PDB)。的沉积结构,95%是解决了x射线,4%通过核磁共振,1%由低温电子显微镜。除了少数例外,所有结构解决了两个NIAID中心的坐标会立即提供给公众,他们作为“蓝图”,基于结构的新发现的药物,帮助我们理解分子生物学的病原体,并填写“结构空间”。除了原子坐标,4000多8000年克隆表达和纯化蛋白质是公开免费的。
SSGCID位于太平洋西北部的成员,由彼得·迈勒博士在西雅图儿童研究机构。的克隆和蛋白的生产是由一组由卫斯理范博士Voorhis华盛顿大学。x射线晶体学是由汤姆·爱德华兹博士和他的团队在联合银行(班布里奇岛)。蛋白质的目标不能结晶或结晶,但衍射糟糕的网站是针对两种核磁共振:博士Gabriele Varani华盛顿大学或自己在太平洋西北国家实验室。NMR地点、重组方法用于生成蛋白富含同位素“核磁共振可见”,碳13和氮15。如果指纹1H -15N HSQC谱是有利的(良好的化学位移分散在两个维度),收集一套核磁共振实验对解决的目标蛋白质的结构解决方案的过程详细描述如下。相对于使用x射线方法解决结构,由NMR结构解决方案仍然需要更多的人员参与。因此,要省钱,我们小组解决关于19倍比核磁共振结构由x射线。
不用说,消息传出后,首次报道COVID-19在武汉,中国在2019年12月31日和基因组的测序,我们的团队快速优先结构基因组学努力专注于重要的蛋白质结构的说明SARS-CoV-2。在2月底之前这些努力导致的低温电子显微镜结构SARS-CoV-2突起蛋白(S-protein) SSGCID co-PI博士大卫Veesler华盛顿大学。多个其他结构基因组的努力正在进行中,沿着尽可能迅速的现行政策下社会距离在西雅图,班布里奇岛和里奇兰,佤邦。
主持人:您使用的是片段的基因编码一种蛋白质学习SARS-CoV-2,个别蛋白质的细菌生长。你能告诉我们更多关于这个过程吗?
GB:分子生物学的中心法则是遗传信息可以从DNA, RNA,蛋白质和一些反向转移RNA, DNA信息但没有从蛋白质的RNA反向传输信息。冠状病毒是一种积极意义,单链RNA病毒。一旦人类宿主细胞内,SARS-CoV-2+ RNA直接释放到细胞的细胞质和翻译成蛋白质的宿主细胞的核糖体。有27个蛋白质编码+病毒RNA,其中一种叫做依赖RNA的RNA聚合酶的蛋白质(RDRP),在其他一些较小的病毒蛋白的帮助下,合成的RNA链复制到+ RNA(起点)。一个有机体的基因组进行测序是一次例行的程序和后不久SARS-CoV-2孤立的基因组测序。
由于分子生物学的中心法则以及普遍的“开始”,“停止”和其他+ RNA序列信号,科学家们立即知道相应的双链DNA序列,使相同的蛋白质+编码的RNA(教条计划的第一步)。这些DNA序列被化学合成(商业),插入工程质粒(小圆双链DNA复制独立于染色体)用于转换的能力大肠杆菌细胞(细菌)。质粒被设计成这样,插入DNA的转录和翻译成蛋白质可以开启(表达),化学(通常是糖)。因此,每个病毒蛋白可以通过细菌(DNA重组技术)。糖诱导蛋白表达后的一段时间,收获细胞,细胞溶解(“炸毁”),和使用建立了色谱技术分离蛋白。它是与这个DNA重组技术大肠杆菌绝大多数的蛋白质是由SSGCID。应该注意的是,与一些蛋白质转录后修饰是非常重要的,比如SARS-CoV-2 S-protein。在这种情况下,系统或真核细胞游离行(理想情况下人类)需要用来表达这些蛋白质。
主持人:有27个蛋白质用SARS-CoV-2在全球范围内被研究。这些27蛋白,研究了最广泛?蛋白质是特别令人兴奋的研究用药物发现?
GB:世界各地的实验室可能关注的主要蛋白在病毒的外套,S-protein,和负责复制病毒的蛋白质复合体+ RNA,依赖RNA的RNA聚合酶(RDRP)复杂。
顾名思义,S-protein负责特殊突起可见的电子显微图。这些峰值的组织传授“皇冠”或“corona-like”出现的病毒和负责分配给这些病毒的名字,冠状病毒。正是由于这种糖蛋白结合ACE2的某些细胞表面的受体在我们的呼吸系统。这也是我们的免疫系统所使用的主要抗原识别入侵者和疫苗开发和基于抗体疗法的主要基础。病毒结合ACE2受体本身不会让病毒进入细胞内,峰值蛋白质必须首先被人类蛋白质裂解,furin。这种化学物质可以防止这种蛋白酶激活S-protein可能是一种有效的治疗策略对COVID-19这是假设机制使用的争议药物羟氯喹。
SARS-CoV-2基因组蛋白质编码只有27个,其中包括复制所需的酶+ RNA, RDRP复杂。这是一个功能独家RNA病毒——一种类似复杂的真核宿主细胞中不存在。这种区别使得RDRP复杂的一个很好的目标一个抗病毒药物,因为如果你阻止病毒复制停止传播。一个很有前景的药物是remdesivir, phosphoramidate前体药物MERS-CoV与活动相关的病毒。最近的研究表明,代谢组学remdesivir产品纳入越来越多的RNA更容易比其天然底物,ATP。一旦注册,RNA链延伸三核苷酸后停止。这似乎是幸运的因为SARS-CoV-2的基因组包含一个RNA酶校对,在exononuclease Nsp14。“坏”核苷酸似乎太遥远的从新生的RNA链被Nsp14修理。除了RDRP的主要成分复杂,蛋白质Nsp12,病毒蛋白质Nsp7 Nsp8也可能是复杂的正常运行的必要条件。因此,小分子,阻止这些辅助因子蛋白绑定Nsp12也可能作为抗病毒药物。 Other viral proteins are believed to assist viral replication by trimming away excess RNA (Nsp15), unwind the RNA to assist replication (Nsp13), protecting the viral RNA from host cell RNases (Nsp10 and Nsp16), and creating a mini-environment (bubble) for the assembly of baby viruses (Nsp2, Nsp4, and Nsp6). Drugs that interfere with the function of any of these assistant proteins could also play a role in slowing down the virus.
除了这两个主要策略东倒西歪,如果不是完全淘汰赛,病毒是一组“辅助蛋白质”,其功能所知甚少。这些蛋白质被称为开放,开放阅读框架,其中有五个(Orf 3、Orf6 Orf7a, Orf8,和Orf10)。的主要氨基酸序列Orf8非常不同于相应的蛋白质中观察到其他冠状病毒和Orf10没有相应的蛋白质。
“我和我的同事感到自豪的快速优先级建立了结构生物学资源迅速应对COVID-19激动人心的工作,影响到每个人的生活在这个星球上。”
主持人:你是如何管理大型数据集生成通过研究呢?
GB: 快速的回答是,从计算的角度来看这不是一个问题。然而,因为仍有大量人类组件使用核磁共振光谱学在解决蛋白质结构,必须保持组织采用“accounting-like”概念。这是因为解决蛋白质结构的核心使用核磁共振光谱,需要分配的化学转变为广大质子,碳、氮原子。例如,107年的经验公式——人类高机动组蛋白残留HMGA是C487年H833年N163年O167年年代1。这意味着潜在的487个碳,氢,833和163氮化学变化需要分配给相应的化学结构的位置。这是一个大量的原子,这并不是一个特别大的蛋白质。作业可以完成一系列的解释两个,三个,甚至四维核磁共振数据集实验过程,实质上是“连接点(交叉峰)”各种光谱。手里拿着这些作业,计算机程序可以理解最重要的核磁共振数据集的结构计算,NOESY数据集。
这是一个实验,确定对等效质子通过空间彼此“交谈”,通过所谓的核奥佛好塞效应(一)。这个一个信号的大小正比于1 / r6,通常是发现不了的距离大于约6。因此,不确定~ 6内的质子,每一个的力量对质子之间的距离成正比。结构计算程序把这个信息(以及其他数据,如化学位移和扭转角预测范围)混合在一起一些分子动力学喷出的整体结构满足实验的输入。而整个过程需要大量的原始核磁共振数据的积累在两到三周的NMR谱仪(没有非均匀抽样),存储空间很便宜。所有这些原始数据可以被转换成一个可判断的形式很容易与适度的计算机系统和输出存储和分析今天的强大的个人笔记本电脑。最后,在任何给定的时间我将有10 - 20蛋白质的核磁共振数据处理我的笔记本电脑,我可以在任何地方工作。如果我不匆忙,我甚至可以执行结构的计算自己笔记本电脑(不过,我通常登录到更大的电脑用电这样做是快得多)。
post-COVID-19世界”很重要,我们不要让我们的警惕,我们继续推动科学研究的前沿保持领先一步的其他传染病潜伏等待一个弱点在我们的盔甲。”
主持人:你工作主要是在晚上,当实验室人员是最小的,社会距离是容易。COVID-19爆发是怎么影响你的典型研究常规?你遇到什么重大挑战吗?
GB: 说实话,在正常时期科学家投入更多的比你的典型的每周工作40小时。这部分是因为白天通常很难得到固体块的实际工作完成,特别是在湿实验室,由于中断了会议和社交活动。就我个人而言,我的日常工作是在晚上,如果我不工作在家写论文,我常常回到实验室完成几件事原状(家里只有五分钟车程)。pre-COVID-19天的主要区别在于,我经常这么做之前或之后一个晚上beer-league曲棍球比赛(博士球迷可能会喜欢知道我管理华盛顿TimeLords)。
现在,我显然有更多的时间可以在晚上湿实验室工作。因此,这不是一个改变更多晚上轮班工作后COVID-19社会距离的要求。我通常不会抱怨长周,特别是关于实验室的一部分,因为有多少人得到工作在他们的爱好吗?总之,晚上把更多广泛的远程工作的转变是容易的,因为很多人在白天,我现在白天基本上未遭毁坏。最大的挑战是习惯于戴手套在实验室日常(另一个COVID-19授权)。未来最大的挑战可能会习惯于戴着口罩,当更多的人回到实验室。
主持人:感觉如何成为一个科学家的贡献全球努力理解和对抗SARS-CoV-2吗?
GB: NIAID建立两个结构基因组学中心致力于生物负责传染病的目标建立一个图书馆的三维蛋白质结构的潜在药物靶点可能用作structure-guided“蓝图”新药的设计。有一个伟大的紧迫性原因很多的新疗法。最重要的是,治疗许多传染病的数量减少是由于抗菌素耐药性的出现在细菌和真核生物病原体(参见2020年特刊的蛋白质科学)。第二,快速气候变化的潜在后果是出现的流行病传染人畜共患疾病疾病携带者的栖息地变化使人类新的传染性病原体。第三,对于一些传染性疾病不存在任何行之有效的治疗方法。COVID-19的迅速蔓延,关闭整个世界在几个月内都突出了脆弱的平衡人与微生物世界连续之间的战争。
我和我的同事感到自豪的快速优先级建立了结构生物学资源迅速应对COVID-19激动人心的工作,影响到每个人的生活在这个星球上。我们当然不值得表扬,这一切对我们英勇的第一反应者(我们实验室现在可能是城里最安全的地方之一)。post-COVID-19世界然而,这将是重要的,我们不要让我们的警惕,我们继续推动科学研究的前沿保持领先一步的许多其他传染性疾病潜伏等待一个弱点在我们的盔甲。
主持人:根据你的这个领域的专家,你想象在未来突破SARS-CoV-2研究空间,与特定的参考结构生物学吗?
GB: m蛋白的结构。这是一个222 -残留蛋白质不可或缺的一部分病毒表面暴露的上衣。残留1 - 103预计包含三个膜跨越地区和残留104 - 222被暴露于病毒的外表面。现在还不知道如果这个蛋白质发挥其他功能角色除了帮助团结病毒外套。解决膜蛋白的结构是具有挑战性的。这种膜蛋白可能特别具有挑战性,因为它太小了,使用当前低温电子显微镜方法确定。因此,可能需要使用更多的异国情调的方法来获得完全蛋白质的结构,如放置13C -,15N-labeled蛋白质进入nanodiscs -合成模型膜系统和解决其结构使用NMR-based方法。这种方法可能需要大量的时间反复试验来优化核磁共振数据采集条件。
加里Buchko与莫莉坎贝尔说,科普作家、技术网络。188金宝搏备用
