琼脂糖凝胶电泳，它是如何工作和它的用途

简单的物理定律表明，当电流作用于含有带电物质的介质时，这些物质将向相反的电荷移动。根据它们移动的介质，其他特征——比如物种的大小——会影响它们的运动，导致分离。这是电泳技术的基础，如琼脂糖凝胶电泳，是广泛应用于整个生命科学的技术。

在这篇文章中，我们将考虑琼脂糖凝胶电泳是如何工作的，它是如何解释的，以及它的一些目的。

什么是电泳?

电泳是一种利用电流根据DNA、RNA或蛋白质的物理性质(如大小和电荷)分离DNA、RNA或蛋白质的技术。

什么是琼脂糖凝胶电泳?

琼脂糖凝胶电泳是一种用于根据核酸(DNA或RNA)片段大小进行分离的电泳方法。当施加电流时，带负电荷的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔隙向带正电荷的凝胶端迁移，较小的片段迁移得更快。然后可以使用紫外线(UV)光来观察所得的波段。

RNA,¹然而，它倾向于形成二级结构——有时同一片段有多个不同的物种——这影响了它的迁移方式。因此，观察到的波段并不总是代表它们的真实大小，图像是模糊的。因此，尽管天然琼脂糖凝胶可以估计RNA的数量和完整性，但它们往往不用于分析RNA大小(在不破坏分析物的自然结构的条件下)。备选方案包括northern变性琼脂糖凝胶电泳²利用能够破坏二级结构的条件。

琼脂糖凝胶也可用于分离蛋白质^3.基于它们的大小和电荷(与DNA/RNA不同，蛋白质的电荷根据所结合的氨基酸而变化)。然而，由于琼脂糖凝胶的大孔径，蛋白质通常被分离聚丙烯酰胺凝胶它们的孔隙更小，为小蛋白质分子提供了更高的分辨率。

因此，我们将重点放在DNA琼脂糖凝胶电泳在这篇文章的其余部分。

凝胶电泳是如何工作的?

琼脂糖是琼脂的一种成分。它形成了螺旋琼脂糖分子的三维凝胶基质，这些分子被氢键束缚在超螺旋束中，分子可以通过通道和孔。当加热时，这些氢键断裂，将琼脂糖变成液体，并允许它在重置之前倒入模具(图1)。

图1: 琼脂糖凝胶的孔隙形成和温度诱导的状态转变。

的琼脂糖百分比包含在凝胶中的物质会影响孔隙大小，从而影响可能通过的分子的大小和它们通过的速度。琼脂糖的百分比越高，孔径越小，因此能够通过的分子越少，迁移速度越慢。在分子生物学实验室中，通常使用0.7-1%琼脂糖凝胶进行日常DNA分离，在0.2-10 kb范围内提供良好，清晰的片段分化。较大的碎片可以用较低百分比的凝胶来分解，但它们变得非常脆弱，难以处理，而较高百分比的凝胶可以更好地分解小碎片，但很脆，可能会凝固不均匀。

由于DNA是肉眼不可见的，所以插入染料如溴化乙锭(EtBr)在凝胶凝固过程中掺入。这与DNA结合，并在紫外线下发出荧光，使DNA片段可见。DNA越多，条带越亮。

与上样染料混合的样品被放置在凝胶的一端，凝胶浸入流动缓冲液中。然后，电流通过凝胶罐两端的电极通过凝胶(图2)。

图2: 琼脂糖凝胶电泳装置示意图。琼脂糖凝胶放置在缓冲液罐中，与负载染料混合的样品放置在凝胶一端的孔中，并施加电流使带负电荷的DNA向正极(阳极[更新，2023年2月13日])移动。

当样品运行足够远以获得足够的分离时，将凝胶从槽中取出并放置在紫外线灯箱上。然后，插入染料可以使样品条带可视化，并通过与已知条带大小的DNA阶梯进行比较来确定其大小。迁移距离和片段大小之间的关系是非线性的，增加了包含大小标记作为指导的重要性(图3)。

图3: A)上图描绘了DNA电泳的典型结果。在左侧，有一个大小标记，用作样本DNA片段(碱基对)长度的参考。在标记的右边是三个样品:样品A，样品B和样品c。图像显示了较小的DNA片段如何比较大的DNA片段在琼脂糖凝胶中移动得更远。B)图像右侧的图表显示了DNA片段的大小与迁移距离之间的非线性关系。这是一条负曲线，当DNA片段变大时，它们在凝胶中迁移的距离就会变短。来源:Mckenzielower，在知识共享署名-相同方式共享4.0国际版许可证。

DNA凝胶电泳步骤、凝胶电泳机、电泳缓冲液和电分离

有几个关键步骤⁴参与选择，建立，运行和分析琼脂糖凝胶，我们现在将考虑。

1.确定所需的凝胶百分比- 0.7- - - - - -1%琼脂糖凝胶通常适用于大多数应用，但重要的是选择适合您的样品和预期片段大小的百分比。将琼脂糖粉与此混合缓冲用于运行凝胶和加热以熔化混合物，避免沸腾。三乙酸乙二胺四乙酸(TAE)或三硼酸乙二胺四乙酸(TBE)⁵通常是缓冲液的选择，因为三酸溶液是轻微碱性条件下的有效缓冲液，可以保持DNAdeprotonated可溶于水。EDTA,螯合剂使核酸酶失活，而核酸酶可能会破坏被分析的DNA。

2.倒上凝胶-选择所需尺寸的凝胶铸造模具和梳子，为所有样品提供足够数量的孔，并提供梯子和孔容量以容纳要装载的每个样品的数量。用铸造框架或胶带固定模具的开口端，以在凝胶凝固时容纳凝胶。添加DNA插层染料进入模具底部-为EtBr, 0.2-0.5µ通常使用G /ml。EtBr是诱变剂的证据仍然目前讨论但结果是，许多实验室已经转向其他选择⁶比如GelRed。加入凝胶，注意不要填满模具，并确保插入染料混合均匀。不要在太热的时候倒凝胶，否则模具可能会变形或断裂。

3.将样品/梯子与上料染料混合- - - - - -加载染料执行多种功能。他们允许用户看到他们的无色样品在哪里，使其更容易将样品准确地移到井中，从而减少井之间样品交叉污染的可能性。当凝胶运行时，染料随样品移动，允许用户告诉凝胶中样品到达的位置，并防止它运行得太远而丢失在缓冲液中。没有装载染料的DNA样品在装载时也倾向于分散到运行缓冲液中，因为它们的密度较低。因此，大多数上样染料含有甘油或菲科尔，这使得样品-染料混合物更密集，因此它会沉淀在孔的底部。溴酚蓝是一种受欢迎的着色剂，但有些也含有额外的染料，如二甲苯。虽然可以购买装载染料，但许多实验室选择自己制作。⁷

如果您运行的样本量非常小(例如，小于5µL)，添加一点可能是有利的水在这个阶段，更容易有效和均匀地加载凝胶孔。同样，如果你期望某些样品中的DNA浓度比其他样品高得多，那么在这个阶段也可能有必要在这些浓缩样品的样品染料混合物中加水。如果不这样做，在可视化过程中，这些波段发出的强信号可能会掩盖较弱的波段，或者需要强波段过度暴露以查看较弱的波段，从而在凝胶图像上产生明亮的扭曲区域。

4.装上凝胶-从固定凝胶上取下浇注框/胶带，并将其放入凝胶罐中，确保孔位于负极端(黑色电极)。用流动缓冲液(TAE或TBE)填充槽，使凝胶被淹没。小心地取下梳子，轻轻地将样品-染料(如果使用的话还有水)混合到孔中。尽量避免用移液管尖端接触孔的边缘，因为它们可能会破裂，使一个样品进入下一个样品。超载井也会产生同样的结果。大量的DNA也会减缓跑步过程中的DNA迁移。负载标记梯子，最好在样本行的两端各有一个。凝胶可能并不总是在一条完美的直线上运行，所以在每一端都有一个梯子可以更容易地确定存在的碎片的大小。各种不同尺寸的梯子可供选择;选择一个最适合您期望看到的片段大小的。

5.运行凝胶-将电极从黑色到黑色，从红色到红色的盖子放在水箱上，并将电极插入电源组，也是从黑色到黑色，从红色到红色。这个，和凝胶罐一起，组成了凝胶电泳机。确保电极和盖子是正确的，否则你的样品会从孔中跑出来，进入运行缓冲液。设定凝胶运行的时间和电压;120v电压35分钟是一个很好的近似值，但是这应该根据所使用的凝胶百分比和分离的预期片段大小进行调整，以提供良好的效果电分离。对琼脂糖凝胶施加电流会使其升温，电压越高，它就会越热，所以当运行低百分比的凝胶时，建议使用较低的电压以防止熔化。增加电压使凝胶运行得更快是很诱人的。然而，这可能会导致“笑脸胶”，其中条带两端向上弯曲，使其难以确定正确的条带大小。这是凝胶开始轻微融化的地方，使得条带不均匀。这也会导致色带出现污浊和不清晰。

6.可视化-一旦样品沿着凝胶的大部分路径运行(染料前端将使其可见)，关闭电源组。戴上手套，轻轻地将模具中的凝胶从槽中取出，排出多余的运行缓冲液，并将其转移到适当容器中的紫外线箱中进行可视化。更换手套，以防止周围表面、门把手等受到凝胶或流动缓冲液中插入染料的污染。如果下游应用需要DNA片段，则可以用手术刀刀片从凝胶中小心地切除相应的条带，同时将其放在暗室的紫外线灯箱中。当灯箱打开时，请戴上防紫外线面罩，并遮住皮肤，以防止紫外线对皮肤或眼睛的伤害。

如何读取凝胶电泳

琼脂糖凝胶可以在暗室的紫外线灯箱上可视化，或者使用连接到相机的独立灯箱。无论使用哪种系统，紫外线从下面照射通过凝胶，DNA条带由于与它们结合的插层染料而发出荧光。这可能会被捕获使用相机与专门的紫外线过滤器为您的记录。标记梯子附带一个指南，以表明每个波段的大小，他们包括。通过将其与样本通道中的条带进行比较，可以确定条带的大小。样品之间的DNA的相对量也可以进行比较，因为更高的DNA浓度会产生更亮的条带。图4显示了一个示例。

图4: 琼脂糖凝胶(2%)分析从肺部症状患者支气管肺泡灌洗(BAL)诊断标本中提取的DNA的pcr扩增产物。资料来源:美国疾病控制与预防中心。

凝胶电泳的目的是什么?

DNA片段的分离可能是可取的原因有很多，其中许多原因在生命科学学科中广泛应用。让我们考虑一些常见的目的。

• 样本DNA可视化
  分离和可视化DNA片段允许用户确定:
  
  样本中是否存在DNA-这可以确认，例如，如果DNA提取或聚合酶链反应在一个诊断测试因此可以确定样品是阳性还是阴性。
  
  DNA片段的大小-例如，如果进行PCR或酶切酶切，酶带是否符合预期大小?这可以证实基因工程实验是否成功，或者可能表明基因插入或缺失的存在或缺失⁸或者重复区域⁹这可以作为一些遗传疾病的诊断工具。当准备DNA新一代测序因此，为了高效测序，用于文库制备的DNA片段必须具有正确的大小。
  
  存在的DNA数量-虽然有更精确的方法来精确DNA量化,¹⁰如紫外可见光谱，当在凝胶上运行样品时，产生的条带强度可以大致了解样品中相对于其他样品的DNA含量。
  
  样品多么干净啊-虽然在某些情况下可能会出现模糊的条带，例如在运行整个基因组DNA时，但通常可能期望从PCR或限制性酶切中得到清晰，清晰的条带。弥漫性条带或涂片可能表明PCR条件或引物不理想，消化不完全或DNA样品中存在干扰污染物，如RNA。
  
• 分离DNA片段进行纯化
  当下游应用需要DNA片段时，比如克隆，¹¹或以下限制消化，从总样品中分离出特定大小的DNA片段可能是可取的。为了达到这个目的，消化或扩增的样品可以在凝胶上流出，并将含有感兴趣片段的凝胶片切除。清洁工具和规程^12，13可用于纯化琼脂糖凝胶中的DNA，然后再进行下游步骤。
  
• Southern印迹法分离DNA片段
  南部的印迹是一种用于检测样本中特定DNA序列的技术。为了做到这一点，DNA片段首先必须通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后才能探测目标序列。
  
• 电泳迁移率转移测定(emsa)
  EMSA,¹⁴也称为凝胶移位测定法，用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。的绑定示例可能包括转录因子¹⁵促进或阻止基因表达。当蛋白质与DNA片段结合时，它会改变DNA在琼脂糖凝胶中的迁移方式，从而产生“移位”。因此，通过运行DNA片段与假定的DNA结合蛋白或不含DNA结合蛋白的不同组合，可以确定结合何时发生或未发生，从而确定目标序列。

DNA琼脂糖凝胶电泳术语

术语	定义
琼脂糖凝胶电泳	琼脂糖基质中用于分离大分子(如DNA片段)的一种电泳方法。
螯合剂	与金属离子反应形成稳定的水溶性金属复合物的化合物。
变性琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶在破坏DNA、RNA或蛋白质的自然结构的条件下运行，导致它们展开。
去质子化	质子(H)的消失+)。
DNA阶梯/标记阶梯	一种由已知大小的DNA片段组成的溶液，可用于推断未知样品中片段的大小。
电分离	利用电流根据生物分子的大小和/或电荷来分离生物分子，如DNA、RNA或蛋白质。
电泳	一种利用电流根据DNA、RNA或蛋白质的物理性质(如大小和电荷)分离它们的技术。
电泳迁移率转移测定(EMSA)	emsa也称为凝胶移位测定法，是一种基于电泳的技术，用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。
凝胶电泳机	用于进行凝胶电泳的设备，通常由凝胶罐和带有连接电极的电源组组成。
插层染料	结合双链DNA的染料，使它们在紫外线下可见。
加载染料	一种用于制备DNA阶梯和电泳样品的染料，使其能够用肉眼看到并增加其密度以防止分散。
诱变剂	导致DNA复制错误的化学或物理现象。
天然琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶在允许保存生物分子(如DNA、RNA或蛋白质)的自然结构的条件下运行。
北部的污点	一种用于检测样品中特定RNA序列的技术，采用电泳进行样品分离。
核酸酶	切割核酸(如DNA或RNA)的酶
聚丙烯酰胺凝胶电泳	在聚合的丙烯酰胺基质中用于分离大分子(如核酸和蛋白质)的一种电泳形式
限制消化	一种利用酶根据周围DNA序列在特定位置切割DNA的过程。
运行缓冲	缓冲液用于填充浸入凝胶并将其运行的容器的缓冲液。它有助于维持稳定的条件。
二级结构	由邻近残基之间的静电吸引而形成的多肽或多核苷酸的三维结构。
印迹	一种用于检测样品中特定DNA序列的技术，采用电泳进行样品分离。
转录因子	参与将DNA转化或转录成RNA过程的蛋白质。

参考文献

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修正
文章错误地将正极表示为阴极，这在2023年2月13日进行了更新，以正确地将阳极识别为正极。