光学显微镜、光学显微镜技术及应用概论

自然界中一些最基本的过程发生在微观尺度上，远远超出了我们肉眼所能看到的极限，这推动了技术的发展，使我们能够看到超越这个极限的东西。早在4^th公元13世纪，人们发现了光学透镜的基本概念^th世纪以来，人们已经开始使用玻璃镜片来提高视力，并放大植物和昆虫等物体以更好地理解它们。¹随着时间的推移，这些简单的放大镜发展成为先进的光学系统，被称为光学显微镜，它使我们能够看到和理解超越我们感知极限的微观世界。今天，光学显微镜是许多科学和技术领域的核心技术，包括生命科学、生物学、材料科学、纳米技术、工业检验、法医等等。在这篇文章中，我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上，我们将讨论一些目前常用的更先进形式的光学显微镜，并比较它们在不同应用中的优缺点。

什么是光学显微镜?

光学显微镜是用来使小结构和样品可见，通过提供它们如何与可见光相互作用的放大图像，例如，它们的吸收，反射和散射。这对于理解样品的样子和组成是很有用的，但也让我们看到微观世界的过程，比如物质如何在一个物体中扩散细胞膜．

显微镜的组成部分以及光学显微镜的工作原理

基本上，显微镜包括两个子系统:照亮样品的照明系统和成像系统，成像系统产生与样品相互作用的光的放大图像，然后可以用眼睛或使用摄像系统查看。

早期的显微镜使用一种由镜子收集并反射到样品上的阳光组成的照明系统。今天，大多数显微镜使用人造光源，如灯泡、发光二极管(led)或激光来制造更可靠和可控的照明系统，这些系统可以针对特定的应用进行定制。在这些系统中，来自光源的光通常使用聚光透镜收集，然后在聚焦到样品上之前进行定型和光学滤波。塑造光线对于实现高分辨率和对比度至关重要，通常包括控制被照亮的样本区域以及光线撞击它的角度。照明光的光学滤波，使用光学滤光片修改其光谱和偏振，可用于突出样品的某些特征，以提高弱信号的可见性或观察样品的荧光。


图1:基本复合显微镜:光源的光通过反射镜和聚光镜聚焦到样品(物体)上。来自样品的光被物镜收集，形成中间图像，由目镜再次成像并传递到眼睛，眼睛看到的是放大的样品图像。

成像系统收集与样品相互作用的照明光，并产生可查看的放大图像(图1)。这是通过两组主要光学元件实现的:

• 首先,一个物镜这样可以从样品中收集尽可能多的光
• 第二,一个目镜它将收集到的光传输到观察者的眼睛或摄像系统。

成像系统还可以包括从样品中选择特定部分光的光圈和滤光片等元件，例如只看到从样品中散射出去的光，或只看到特定颜色或波长的光。在照明系统的情况下，这种类型的过滤可以非常有用地选出感兴趣的某些特征，这些特征在成像来自样品的所有光时仍然隐藏。

总的来说，照明和成像系统在光学显微镜的表现中起着关键作用。为了在您的应用中充分利用光学显微镜，有必要很好地了解基本光学显微镜的工作原理，以及今天存在哪些变化。

暗场显微术

暗场显微镜是一种只收集被样品散射的光的技术。这是通过添加光阑来实现的，它可以阻止照明光被直接成像，这样只有被样品散射的照明光才能被看到。这样，暗场显微镜突出了散射光的小结构(图6)，并且可以非常有用地揭示在BFM中不可见的特征，而无需以任何方式修改样品。然而，由于最终图像中看到的唯一的光是已经散射的光，暗场图像可能非常暗，需要很高的照明功率，这可能会损坏样品。


图6:亮场和暗场成像。a)亮场照明下聚合物微观结构。b)与a)相同结构的暗场图像，突出显示边缘散射和表面污染。c)结构与a)和b)相似，被直径100- 300nm的纳米晶体覆盖。只观察到被纳米晶体散射的光，而背景光被强烈抑制。来源:作者。

相衬显微术

相位对比显微镜(PCM)是一种技术，可视化的变化引起的光学相位样品的变化光程长度．这使得在BFM中产生很少或没有对比度的透明样品成像成为可能，例如细胞(图7)。由于光学相移不容易被肉眼观察到，因此相位对比显微镜需要额外的光学元件来将样品引起的相移转换为最终图像中可见的亮度变化。这需要使用光圈和滤光片对照明系统和成像系统进行操作。这些形状和选择性相移都来自样品的光，它携带感兴趣的相位信息，和照明光，使它们建设性地干扰眼睛或探测器，以创建一个可见的图像。

图7：人类胚胎干细胞集落的相位对比显微镜。Sabrina Lin, Prue Talbot，加州大学河滨分校干细胞中心。

差分干涉造影术

差分干涉对比显微镜(DICM)通过将由于样品光程长度变化而产生的光学相位转换为干涉可见对比，类似于PCM，从而实现透明样品(如活的、未染色的细胞)的可视化。然而，与PCM相比，DICM可以实现更高分辨率的图像和清晰度，并且减少了由PCM所需的光学引入的图像伪影。在DICM中，照明光束由线性偏振器偏振，其偏振旋转，使其分裂为两个偏振光束，具有垂直偏振和一个小(通常小于1µm)的偏振。^3.他们之间的分离。在遍历样品后，两个光束重新组合，使它们相互干扰。这将创建一个与对比度成比例的图像区别在两个偏振光束之间的光学相位，因此得名“微分”干涉显微镜。由DICM产生的图像与采样光束之间的位移方向相关，看起来是三维的，这导致样品的边缘具有明亮或黑暗的区域，这取决于两者之间光学相位差的符号(图8)。

图8:差分干涉造影术。左:DICM的原理图设置。右图:活的成年人秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫) DICM成像线虫。来源:Bob Goldstein, Cell Image Library。转载于创作共用属性3.0未移植许可(CC BY 3.0)。

偏振光显微镜

在偏振光显微镜中，样品被偏振光照射，光的检测也对偏振光敏感。为了实现这一点，偏振器被用来控制照明光偏振和限制偏振检测成像系统只有一个特定的偏振。通常，照明和检测偏振设置为垂直，以便不需要的背景照明光，没有与样品相互作用被强烈抑制。此配置需要一个 双折射样本 引入了照明光偏振角的旋转，从而可以被成像系统检测到，例如观察晶体的双折射以及它们的厚度和折射率的变化(图9)。

图9:偏光显微镜。橄榄石堆积的显微照片，由具有不同双折射性的晶体堆积而成。样品的厚度和折射率的变化导致了不同的颜色。资料来源:R. Hill, CSIRO。

荧光显微镜

荧光显微镜用于成像荧光样品，也就是说，当用较短波长的光照射时，它们会发出长波长的光。例子包括本质上具有荧光或已用荧光标记物标记的生物样品，以及单分子和其他纳米级荧光团。该技术采用了一种光学滤光片的组合，它可以阻挡短波长的照明光，但让长波长的样品荧光通过，这样最终的图像只显示样品的荧光部分(图10)。这允许从由许多其他非荧光颗粒组成的样品中选出和可视化已用染料染色的荧光颗粒或感兴趣的细胞的分布。同时，荧光显微镜还可以通过标记小于这一极限的颗粒来克服传统光学显微镜的分辨率限制。例如，可以用荧光标记标记病毒以显示其位置⁴或者荧光蛋白，比如绿色荧光蛋白，⁵在生物样品的情况下可以表达。这项技术也被用于检测塑料微粒．结合各种新形式的样品照明，荧光显微镜的这种优势使“超分辨率显微技术⁶这打破了传统光学显微镜的分辨率限制。荧光显微镜的主要限制之一是光漂白，其中标记物或颗粒停止荧光，因为吸收照明光的过程最终改变了它们的结构，使它们不再发光。

免疫荧光显微镜

我免疫荧光显微镜是荧光显微镜的一种特殊变体，主要用于微生物学中可视化细胞内生物分子的位置。在这里，带有荧光标记的抗体或具有本质荧光的抗体与感兴趣的生物分子结合，揭示它们的位置。⁷

共焦显微镜

共焦显微镜是一种显微镜技术，图像散射或荧光从一个样品点。而不是照亮和成像整个样品一次，一个来自点状源的照明点被扫描到样品区域，只有来自该点的光被敏感探测器检测到，产生一个2D图像。这种方法允许在高分辨率下成像具有弱信号的样本，因为来自采样点以外的不需要的背景信号被有效地抑制。在这里，使用的波长和物镜限制了成像光斑在所有三个维度上的大小。这允许通过移动物镜到距离样品不同的距离，在样品内的不同深度制作2D图像。然后可以将这些2D图像“切片”组合起来，以创建样品的3D图像，这是其他讨论的宽视场显微镜技术所不可能实现的，并且还可以以3D方式测量样品尺寸。这些优点的代价是不能一次性拍摄图像，而是必须逐点建立图像，这可能很耗时，并且抑制了样本的实时成像(图12)。


数字 12 ：单分子荧光共聚焦荧光图像。小点对应单个分子的荧光，而大点对应分子簇。这里的荧光背景比简单的荧光显微镜图像弱得多，可以从亮点之间的暗区看到。来源:作者。

双光子显微镜

双光子显微镜(TPM)是荧光显微镜的一种变体，它使用双光子吸收来激发荧光而不是单光子激发。在这里，荧光是通过吸收两个光子的组合来激发的，大约是单个光子激发所需能量的一半。例如，在这种方案中，通常由单个蓝色光子激发的荧光团可能由两个近红外光子激发。在TPM中，就像在共聚焦显微镜中一样，图像是逐点建立的，即双光子激发点在样品上被扫描，样品荧光由灵敏探测器检测。与传统荧光显微镜相比，激发和荧光能量的巨大差异导致了多个优势:首先，它允许使用更长的激发波长，在样品内散射更少，从而穿透得更深，从而允许在其表面以下对样品成像并创建3D样品图像。同时，由于激发能量较低，光漂白过程大大降低，这对于易碎样品非常有用。来自激发点周围的荧光背景也大大减少，因为有效的双光子吸收只发生在激发光束的焦点处，因此可以观察到来自样品的一小部分荧光(图13)。

TPM的一个缺点是双光子吸收的概率远低于单光子吸收，因此需要高强度的照明，如脉冲激光，以达到实际的荧光信号强度。

薄片显微术

光片显微镜是荧光显微镜的一种形式，样品被垂直于观察方向的薄“片”光照亮，这样只有样品的薄部分(通常是几微米)被成像。⁸ 当样品在光片中旋转时，通过拍摄一系列图像，可以形成3D图像。这就要求样本大部分是透明的，这就是为什么这项技术经常被用于形成小而透明的生物结构的3D图像，如细胞、胚胎和生物等斑马鱼 ⁹(图14)。

图14:光片显微术。左:工作原理。右图:用荧光成像技术在光板显微镜下拍摄的小鼠大脑荧光图像。来源:维基共享资源Fenerliabi11。转载于Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International许可证(CC BY-SA 4.0)。

全内反射荧光显微术

全内反射荧光(TIRF)是一种荧光显微镜技术，允许2D荧光图像由极薄(约100纳米厚)的样品切片制成。¹⁰这是通过在不同折射率(n)的两种材料之间的边界处进行全内反射时，照明光的倏逝场激发样品的荧光来实现的。倏逝场与照明光具有相同的波长，但与界面紧密结合。在TIRF显微镜中，激发光通常在玻片(n = 1.52)和分散在其中的水介质(n = 1.35)之间的界面上进行全内反射。消失场的强度随着距离界面的距离呈指数下降，这样在最终的图像中只有靠近界面的荧光团被观察到。这也导致了来自切片外区域的荧光背景的强烈抑制，这使得弱荧光信号被拾取，例如当定位单个分子时。这使得TIRF在观察参与细胞间相互作用的荧光蛋白的微弱信号(图15)时非常有用，但也要求样品分散在水介质中，这可能限制了可测量样品的类型。


图15:在培养的视网膜色素上皮细胞中显示蛋白质荧光的TIRF图像。每个像素对应67 nm。资料来源:Allen Liu, Sandra L. Schmid, Cell Image Library。

扩张显微镜

扩展显微镜的基本概念是增加样品的大小，通常需要高分辨率显微镜，这样它就可以用标准显微镜技术成像，特别是荧光显微镜。这适用于保存的标本，如生物分子、细胞、细菌和组织切片，它们可以在所有维度上(各向同性)均等地扩展，使用化学过程最多可扩展50倍¹¹如图16所示。扩展样本可以隔离通常隐藏的单个感兴趣的特征，并可以使它们透明，从而使其内部成像。

图16：用于膨胀显微镜的样品制备。细胞首先被染色，然后连接到聚合物凝胶基质上。然后细胞结构本身被溶解(消化)，使染色部分随着凝胶向各向同性扩张，使染色结构得到更详细的成像。

光学显微镜中的反褶积

除了使光学系统适应特定的用例，现代光学显微镜还利用数字图像处理，如图像反褶积。¹²该技术通过补偿光学系统本身固有的模糊，增加了光学显微镜拍摄的图像的空间分辨率和定位精度。这种模糊可以在校准步骤中测量，然后可以稍后用于反卷积图像，从而减少模糊。通过将高性能光学与先进的图像处理相结合，数字显微镜¹³可以突破分辨率的极限，看到更深入的微观世界。

图17:图像反褶积。左:原始荧光图像。右图:反褶积后的图像，显示增加的细节。来源:作者。

光学显微镜和电子显微镜的区别是什么?

光学显微镜通常使用可见光光谱中的光波长，这固有地限制了它的空间分辨率，由于瑞利准则大约一半的波长使用(最好约200 nm)。然而，即使在使用高NA和高级图像处理的物镜时，这一基本限制也无法克服。相反，观测较小的结构需要使用较短波长的电磁辐射。这是基本的原则电子显微镜，电子被用来照亮样品而不是可见光。电子具有比可见光短得多的相关波长，可以实现高达10,000,000倍的放大，这样即使单个原子也可以被分辨。¹⁴


图18:扫描电子显微镜图像在15,000倍放大的同心聚合物结构的纳米晶体。甚至像基底孔隙这样的细节也被解决了。来源:作者。

总结与结论

光学显微镜是一个强大的工具，检查小样本在一个大范围的应用。通过调整用于特定用例的照明和成像技术，可以获得高分辨率图像，从而深入了解样品中的微观结构和过程。在这篇文章中，我们讨论了各种光学显微镜技术的特点、优点和缺点，这些技术在光撞击和收集的方式上有所不同。

光学显微镜技术对照表

技术	优势	限制	典型的应用
亮场显微术	相对简单的设置，光学元件很少	低对比度，完全透明的物体不能直接成像，可能需要染色	对着色或染色样品进行成像15部分透明材料16
暗场显微术	显示小的结构和表面粗糙度，允许成像未染色的样品	所需的高照明功率会损坏样品，只能看到散射的图像特征	成像细胞中的粒子，17表面检查18
相衬显微术	允许透明样品成像	复杂的光学设置，高照明功率所需的样品，一般较暗的图像	追踪细胞运动，19成像的幼虫20.
差分干涉造影术	分辨率高于PCM	复杂的光学设置，高照明功率所需的样品，一般较暗的图像	未染色活细胞的高分辨率成像21和纳米粒子22
偏振光显微镜	来自样品的非双折射区域的强背景抑制，允许测量样品厚度和双折射	需要双折射样品	成像胶原蛋白,23揭示晶体的晶界24
荧光显微镜	允许单个荧光团和样品中感兴趣的特定区域被挑选出来，可以克服分辨率限制	需要荧光样品和灵敏的检测器，光漂白可以减少信号	成像细胞成分，单分子，蛋白质25
免疫荧光显微镜	使用抗体靶向可视化特定的生物分子	广泛的样品制备，需要荧光样品，光漂白	识别和跟踪细胞26和蛋白质27
共焦显微镜	低背景信号，可创建3D图像	成像速度慢，需要复杂的光学系统	三维细胞成像，成像样本微弱荧光信号，表面剖析28．
双光子显微镜	样品穿透深，背景信号低，光漂白少	成像速度慢，需要复杂的光学系统和大功率照明	神经科学,29深部组织成像30.
薄片显微术	图像只有极薄的样品切片，可以通过旋转样品创建3D图像	成像速度慢，需要复杂的光学系统	细胞和生物的三维成像8
全内反射荧光显微术	背景压制强，垂直切片极细	成像局限于薄面积的样品，需要复杂的光学系统，样品需要在水介质中	单分子成像，31分子运输成像32
扩张显微镜	增加标准荧光显微镜的有效分辨率	样品需要化学处理，不适合活样品	生物样品的高分辨率成像11

B

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