DNA合成:方法、进展和应用

T为了实现强大的新型生物制药的承诺，合成生物学严重依赖于DNA合成的进步，以方便、负担得起和快速获取准确的核酸序列。

下一代DNA测序(NGS)和分子生物学的创新方法和发现从根本上重新定义了读取和编辑DNA的机会和挑战，但相比之下，写入DNA的进展则是增量的。

标准DNA合成，包括目前最先进的基于硅芯片的平台技术，仍然依赖于40年前的磷酰胺化学。该技术无法提供足够质量和数量的长(> 150个核苷酸)DNA，以满足生物制药和合成生物学中新兴应用的需求。在这篇文章中，我们反思了最先进的DNA书写方法和未来DNA合成技术发展的主要方向。

化学DNA合成的历史

20世纪80年代初，科罗拉多大学博尔德分校开发了核苷磷酰胺前体和固体载体方法，实现了DNA合成过程的自动化和商业化，导致合成寡核苷酸的广泛可用性。寡核苷酸和合成DNA现在几乎是最近生物制药发展及其近亲合成生物学的每个方面的重要组成部分。

化学DNA合成方法的成功是显著的，其进步导致了更高的通量，更少的试剂消耗和更低的成本。然而，通过磷酰胺合成DNA本质上受到其化学性质的限制。尽管每次添加构建块的反应通常以99.2%的耦合效率进行，但迭代过程在> 100个核苷酸的序列长度上以快速递减的产量和高复合错误率交付DNA。这些限制，加上所使用的苛刻的试剂和反应条件，突出了启用DNA合成方法的必要性。

酶的方法

幸运的是，不依赖模板的DNA合成在自然界中已经建立。作为脊椎动物免疫反应的一部分，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)聚合酶在“先到先得”的基础上驱动脱氧核糖核苷三磷酸积木的高效随机聚合。对于实验室中特定DNA序列的可控合成，相同的tdt可与四种可逆终止物脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)类似物结合用作催化剂。在一些NGS平台中使用的类似于合成测序(SBS)的过程中，可逆终止子dNTP类似物能够以用户定义的序列特定方式控制起始引物的逐步扩展。与下一代SBS不同，所提出的方法不需要模板核酸，能够新创合成。经过多次循环的延伸和终止端去除，全长的单链聚脱氧核苷酸从固体载体中分离出来，并分离出来供后续使用。由于DNA是通过酶法合成的，所以它是一种完全天然的、具有生物活性的分子;这样就省去了磷酰胺法合成DNA所需要的耗时和诱导修饰的化学操作。

酶DNA合成的挑战和解决方案

除了向更快、更便宜和更环保的方法转变的明显愿望之外，更长的长度和更高纯度的寡核苷酸是席卷科学界的新技术发展浪潮的目标。虽然将较短的寡核苷酸(即< 100个核苷酸)组装成基因长度的双链结构在技术上是可行的，但tdt驱动的较长DNA序列的合成加速了组装过程。这些方法的未来进展甚至可能促进整个基因和基因簇的直接合成。简化后合成过程将降低成本和更快的周转时间。此外，也有比目前经济上可行的更长的更高纯度的单链DNA (ssDNA)分子的应用，也许最令人兴奋的应用是在CRISPR-Cas基因组编辑中的同源定向修复中使用ssDNA。

酶促DNA合成的成功取决于两个截然不同但又相互依赖的因素:有效的聚合(生物)催化剂和正确的可逆dNTPs。原生tdt提供了许多必要的品质，作为酶合成的引擎，基于该酶的几个良好记录的特性的组合。首先，能够以近乎定量的方式扩展引物，从而添加数百到数千个核苷酸，其次，广泛接受各种修饰和取代的dNTP类似物作为有效的底物。

tdt驱动DNA合成的高效特性也带来了一个关键的挑战:每个循环控制添加一个且仅添加一个核苷酸。这个问题的经典解决方案是在dNTP的3 ' -OH上使用可逆终止子来控制加法。不幸的是，TdT对碱基变异的广泛耐受性并不扩展到可逆终止子dNTPs的糖部分的修饰。因此，酶合成发展的新挑战是平衡3 ' -可逆终止物的选择，它既是TdT的有效底物，又能在温和条件下快速移除。通过结合化学家和蛋白质工程师的创造力、经验和专业知识，正在开发修饰的dNTPs和定制的tdt的新组合，以微调这种DNA合成“引擎”，并实现高效、经济地书写DNA的承诺。

未来的前景

酶法合成DNA正处于其技术生命周期的起点。在这项技术的商业应用方面还有巨大的进步。仅举两个例子，新型硬件和具有长保质期的高性能酶都是酶DNA合成未来发展的一部分。这项技术的多功能性还有待充分展示或探索。一个显著的例子是用于治疗、农业和核酸基材料的大规模核酸合成。对反应物进行多次循环的潜力将对这种合成的成本产生巨大影响;目前，化学合成还不存在这种机会。另一个例子是DNA作为信息存储系统的新兴应用。与生命科学应用相比，未来的DNA“硬盘”代表了对合成DNA的无限大的需求，需要替代的酶DNA合成实现，重点是在保持保真的同时降低成本和更高的吞吐量。就像硅加速了计算创新一样，酶DNA合成可能是下一个技术进步时代的关键。 It promises to finally bring “writing” on par with reading and editing DNA.

写的 J. William Efcavitch博士，分子组装联合创始人兼首席科学官，Stefan Lutz博士，Codexis公司研究高级副总裁。