液滴数字PCR可以检测支原体在基因治疗产品

近三分之一全世界的细胞系是属支原体的细菌污染。分子生物学家的麻烦,这些细菌影响细胞生理和经常的几乎所有方面影响研究结果。但是现在,基因疗法进入诊所,支原体威胁研究成果和病人的生命。

今天,大多数基因疗法使用腺相关病毒(AAV)作为核酸交付车辆。装甲防护细胞培养中生长,由于支原体细菌通常存在于细胞培养、基因治疗批次易受污染。这些细菌可以达到患者如果不检测并在基因治疗早期生产的筛选。

一个支原体物种,m .肺炎是致病的。这个物种的原因约200万例细菌性肺炎和100000人住院每年。一些生物学家称它为细菌的一种杂草因为它是无处不在的,很难检测,很难治疗的病人。

随着越来越多的患者接受治疗的装甲防护,这种细菌物种可能会影响甚至更多的生命。因此,biomanufacturers需要敏感的工具来测试支原体在整个开发和制造过程,以确保不达到患者的细菌。

挑战在检测和删除支原体

支原体细菌无处不在,生活从动物细胞培养媒体实验室外套,很容易逃避检测。T嘿,测量只有2 - 3µm,太小了,通过一个标准的光学显微镜镜头。他们是如此之小,他们可以出现在细胞培养上清液的浓度每毫升107个细胞在不影响文化的外观。

即使在检测,从细胞培养支原体细菌很难去除。因为他们是革兰氏阴性,抗beta-lactam抗生素,科学家们通常使用清除细菌污染的细胞系。机械分离也是一个挑战,因为他们的小尺寸使得它容易通过过滤器。

科学家而不是采取直接检测支原体的基因治疗作为他们的唯一希望屏蔽污染批次。传统上,科学家们使用各种方法检测这些bacteria-using肉汤或琼脂试验群体的增长,染色标记他们的遗传物质,或寻找支原体蛋白质。但是这些方法需要一个月交付结果,从而严重减缓生产。定量PCR (qPCR)一天可以检测支原体,但该工具使用标准曲线估计支原体水平在一个示例中,创建可变性,降低了技术的敏感度。

液滴数字PCR mycoplasma检测工具

液滴数字PCR (ddPCR)技术也可以迅速取得成果,但与qPCR, ddPCR措施直接支原体的水平,使其更敏感。

ddPCR技术包括分区10-µL核酸样本到20000年统一1-nL液滴和运行一个单独的每一个反应。与每个液滴只包含一个或几个核酸链,这种技术使研究人员能够执行端点PCR数千次同时对个人DNA链。液滴包含目标序列将发出一个强烈的荧光信号经PCR扩增,而水滴,不包含序列只会发出微弱的荧光。使用泊松统计数据,软件数量的积极与消极的液滴数量得到目标核酸的浓度在原始样本。

ddPCR化验使用probe-based化学和采用三个引物,减少非特异性DNA扩增的发生而qPCR。以这种方式通过量化支原体DNA, biomanufacturers更特定的存在与否支原体在他们的样品和提供安全的基因疗法。

在一个最近的研究,研究人员测试了ddPCR技术的能力和敏感性和特异性检测支原体。团队研究了三种典型的物种在自然界发现的:答:laidlawii,m .肺炎,m . hyorhinis。他们发现检测极限(LOD)为所有三个一直低:的LOD答:laidlawii4.19基因组拷贝(GC) /嗯,LOD的吗m .肺炎6.29 GC /好,对吗m . hyorhinis5.63 GC /。事实上,在直接比较,ddPCR技术检测答:laidlawii标准1集落形成单位/毫升,而qPCR没有。

这些研究人员还测试了大通过比较三支原体的检测物种三控制物种的检测:c . sporogenes,l .嗜酸的,和美国宝。他们证实,ddPCR只化验检测支原体。

日益增长的需要ycoplasma测试在基因治疗的发展

基因疗法进入诊所,所以做一些瘟疫实验室研究污染的挑战。例如,因为一些支原体物种导致人们的疾病,基因疗法必须检查支原体管理病人。尽管基因治疗的复杂性发展,今天的biomanufacturers获得他们需要的工具质量的保证他们的治疗。ddPCR技术是其中的一个工具,它可能会发挥重要作用在确保基因疗法是安全的,对每个人都有效。