探索CRISPR和干细胞研究的最新进展

自2013年CRISPR系统的基因编辑潜力被实现以来，它们已在世界各地的实验室中被用于各种各样的应用。当这种基因编辑的能力与干细胞的增殖潜力结合起来时，科学家们就能提高他们对细胞生物学、人类遗传学和医学未来潜力的理解。

到目前为止，使用CRISPR技术编辑干细胞的可行性已经在两个关键领域得到了证明:建模和研究人类细胞状态和人类疾病，以及再生医学。¹然而，这并非没有挑战。

在本文中，我们将探讨这些领域的一些最新研究，以及科学家们为克服这些挑战所采用的方法。

在ipsc衍生神经元中使用CRISPRi破译细胞特异性基因表达

在iPSCs中部署CRISPR技术一直是出了名的具有挑战性•卡普曼实验室在加州大学旧金山分校他说:“CRISPR引入了DNA断裂，这对iPSCs可能是有毒的，因为这些细胞具有高度活跃的DNA损伤反应。”为了克服毒性问题，作为乔纳森·韦斯曼教授实验室的博士后，坎普曼co-invented一种被称为CRISPR干扰(CRISPRi)的工具，其中CRISPR/Cas9的DNA切割能力被禁用。²“死亡”的Cas9(或dCas9)仍然被单一的引导RNA引导到DNA中。因此，它可以作为一个招募平台，将感兴趣的蛋白质域定位到基因组中的特定位置。

CRISPRi允许在转录水平上抑制基因，而RNAi则在mRNA水平上控制基因。这使得研究人员能够抑制干细胞中的某些基因并破译它们的功能。Kampmann解释说:“对于CRISPRi，我们将一个转录抑制域(KRAB域)定位到基因的转录起始位点，以抑制它们的表达。这种敲除方法非常有效，并且缺乏基于rnai的基因敲除的臭名昭著的脱靶效应。”

在一项研究中发表就在上个月，Kampmann的实验室采用了基于crispr的平台，对源自iPSCs的人类神经元进行基因筛查:“基于crispr的基因筛查可以揭示这些突变导致细胞缺陷的机制，并揭示我们可以靶向纠正这些缺陷的细胞通路。这些途径是潜在的治疗靶点。”^3.

“我们从基因组中的一个安全港位点表达了CRISPRi机制(dCas9-KRAB)，在神经元分化过程中它不会被沉默。我们还开发了带有degron的CRISPRi结构，其稳定性由小分子控制。通过这种方式，我们可以在神经元分化的不同时间诱导CRISPRi敲除感兴趣的基因。”

图片:ipsc衍生神经元。图源:加州大学旧金山分校坎普曼实验室。

以前基于crispr的筛选主要集中在癌细胞系或干细胞上，而不是健康的人类细胞，因此限制了对人类基因细胞类型特异性作用的潜在洞察。研究人员选择筛选ipsc衍生的神经元，因为基因组筛查已经揭示了神经退行性疾病的选择性脆弱性机制，以及神经精神疾病的聚合机制。

大规模的CRISPRi筛选发现了对神经元和iPSCs都至关重要的基因，但当敲除这些基因时，会导致不同的转录组表型。“对我来说，最令人兴奋的发现之一是，我们认为是管家基因的广泛表达基因在iPSCs和神经元中具有不同的功能。这也许可以解释为什么管家基因的突变会以非常不同的方式影响体内不同的细胞类型和组织，”Kampmann说。例如，敲低E1泛素激活酶UBA1，导致包括内质网伴侣在内的大量基因的神经元特异性诱导HSPA5而且HSP90B1．

这些结果表明，包含UBA1在神经元中触发蛋白毒性应激反应，而不是iPSCs -与UBA1在几种神经退行性疾病中的建议作用一致。作者指出:“对所有人类细胞类型的平行基因筛选可能会系统地揭示人类基因在特定环境下的作用，从而对它们如何控制人类生物学和疾病有更深入的机制理解。”

视频来源:UCSF。

利用CRISPR开发和测试基于细胞的人类疾病疗法

全球几家实验室正在竞相利用CRISPR基因编辑技术开发首个临床相关、有效和安全的细胞疗法。

大量的文献证明了CRISPR在编辑哺乳动物细胞基因组方面的功效在体外,因为在活的有机体内应用，特别是人体应用，需要对安全性结果进行严格的长期测试。本月，来自Hongkui邓，香港理工大学教授北京大学在北京发表了一篇论文新英格兰医学杂志。⁴这篇论文概述了他们在世界上首次将crispr编辑的同种异体干细胞移植到一名艾滋病毒感染者体内的研究。

这项研究的基本原理可以追溯到“柏林病人他指的是蒂莫西·雷·布朗，他是世界上极少数被治愈的艾滋病毒感染者之一。布朗接受了来自一名携带这种突变体的人的骨髓移植CCR5基因．在正常情况下，CCR5基因编码白细胞表面的一种受体。这种受体有效地为HIV进入细胞提供了通道。在个体中有两份CCR5突变时，受体就会扭曲，从而限制HIV病毒株进入细胞。

邓和他的同事们使用CRISPR基因编辑供体造血干细胞和祖细胞(HSPCs)来携带一种CCR5插入或删除。基因测序表明，他们能够以17.8%的效率实现这一目标。然后，这些经过crispr编辑的hspc被移植到一名同样患有白血病并需要骨髓移植的艾滋病毒患者体内，目的是根除艾滋病毒。

邓说:“这项研究旨在评估将crispr - cas9修饰的HSPCs移植到hiv -1阳性血液癌患者中的安全性和可行性。”他继续说:“基因组编辑在人类造血干细胞和祖细胞中的成功是从编辑持久性、特异性和长期移植HSPCs的效率三个方面进行评估的。”对HIV患者的长期监测发现，在移植后19个月，经过crispr编辑的干细胞是活的——然而，它们只占总干细胞的5%到8%。因此，病人仍然感染了艾滋病毒。

尽管长期生存的效率似乎很低，但研究人员从安全评估方面的结果感到鼓舞:“以前报道的基于造血干细胞和祖细胞的基因疗法效果较差，因为外源DNA随机整合到基因组中，有时会诱发急性免疫反应或肿瘤，”邓说。“这项研究中明显没有基因编辑的临床不良事件和脱靶效应，这为这种基因编辑方法的安全性提供了初步支持。”

邓说:“为了进一步阐明ccr5切除的HSPCs的抗hiv作用，提高我们CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率并改进移植方案将是至关重要的。”

CRISPR基因编辑和干细胞研究的结合则不然只是支持艾滋病毒治疗的发展。一个正在进行的临床试验正在评估自体CRISPR-Cas9修饰CD34+ HSPCs治疗输血依赖型β-地中海贫血(一种导致血红蛋白缺乏的遗传血液疾病)的安全性和有效性。

这种被称为CTX001的治疗方法包括提取患者的HSPCs，并使用CRISPR-Cas9修饰红系系特异性增强子的细胞BCL11A基因。然后，这些转基因细胞被注入患者体内，在那里它们会产生大量含有胎儿血红蛋白的红细胞。目前还没有结果，但报告证实，参与者已经被招募到试验中。

光明的未来

通过CRISPR技术和干细胞的联合使用，我们对细胞生物学和疾病状态的理解得到了很大的提高。虽然这篇文章主要集中在当前的研究实例，张等最近的。审查提供了该领域的全面观点和早期研究提供的见解。⁵

在这样的综述中，作者评论道:毫无疑问，CRISPR/Cas9基因组编辑系统彻底改变了基础和转化干细胞研究．"仍然需要解决方案来解决CRISPR技术臭名昭著的脱靶效应，提高邓所概述的编辑效率，并开发用于临床干细胞研究的安全的新型递送策略。

尽管如此，CRISPR和基于干细胞的研究前景一片光明。在本月发表的评论中，Bukhari和Müller说:“我们预计CRISPR技术将越来越多地应用于ipsc衍生的类器官:蛋白质功能(亚细胞定位、细胞类型特异性表达、裂解和降解)可以在发育和成年类器官的原生条件下进行研究．"

引用:

1. 耶胡达，谢默和比纳，2018年。利用CRISPR/Cas9对诱导多能干细胞进行基因组编辑。干细胞评论和报告。DOI: 10.1007 / s12015 - 018 - 9811 - 3。

2. 齐等。2013。重新利用CRISPR作为rna引导的基因表达序列特异性控制平台。细胞。DOI: 10.1016 / j.cell.2013.02.022

3. 田等。2019。基于CRISPR干扰的人类ipsc衍生神经元多模态遗传筛选平台神经元。https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.07.014．

4. 徐等。2019。一名HIV和急性淋巴细胞白血病患者的crispr编辑干细胞。新英格兰医学杂志．DOI: 10.1056 / NEJMoa1817426。

5. Zhang等。2019。CRISPR/Cas9基因组编辑系统在人类干细胞中的应用:现状与未来展望分子治疗核酸．DOI: 10.1016 / j.omtn。